厄他培南对米卡芬净大鼠体内药动学的影响

董劼 刘秀菊 李菲菲 李浩然 张志清

米卡芬净是侵袭性真菌病治疗最常见的抗真菌药物[1]，血浆蛋白结合率达到99.8%，且与其他蛋白结合率高的药物相互作用研究不足，以致临床用药存在较大风险。米卡芬净本身存在“矛盾现象”[2]，即指米卡芬净低浓度时真菌表达敏感，但随着药物浓度的增加，真菌对其敏感性却降低，甚至产生耐药的现象[3]。侵袭性真菌感染好发于免疫受损者，如血液恶性肿瘤接受化疗者等[4]且大多伴有基础疾病，患者用药品种多、作用复杂[5]。有数据显示，94.7%的住院患者在三甲医院中应用抗真菌药物之前都应用抗菌药物，以使用2～3种抗菌药物的情况最多，所用药物几乎涵盖所有类别的抗菌药物，包括使用例数较多的碳青霉烯类、头孢菌素类、氟喹诺酮类[6]。而厄他培南作为碳青霉烯类广谱抗生素，克服之前此类药物对脱氢肽水解酶(DHP-1)不稳定的缺陷，且由于广泛的蛋白结合(85%～95%)作用而具有更长的半衰期，可以单次给药[7,8]。当米卡芬净与厄他培南联合用于侵袭性真菌感染患者时，由于二者蛋白结合率都很高，就有可能会造成其中一种蛋白结合能力弱的药物的游离浓度升高，从而增大不良反应发生的风险，甚至降低疗效。截至目前，已经有一些米卡芬净钠与其他药物之间相互作用的临床研究，包括霉酚酸酯、环孢素A[9]、他克莫司、泼尼松龙、西罗莫司、硝苯地平、氟康唑[10]、利托那韦和利福平[11]。其中应留意联合用药的不良反应，在必要时可减少西罗莫司或硝苯地平的给药剂量[12]。作为临床广泛应用于侵袭性真菌病治疗的药物，米卡芬净与厄他培南联用情况空缺。药物相互作用信息不完整，在一定程度上限制了此两种药物的联合应用。本研究拟建立简便、快捷的高效液相色谱(HPLC)方法，用于测定大鼠血浆中米卡芬净的浓度，考察厄他培南对米卡芬净在大鼠体内药代动力学的影响，为临床联合用药提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只健康雄性SD大鼠，清洁级，体重(220±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证：SCXK(京)2012-0001，动物合格证编号：11400700144070，适应性饲养 1 周，期间让其自由饮水饮食。

1.2 仪器与试剂 Waters e2695 HPLC 系统，包括2489紫外检测器，Empower工作软件；Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；超声波清洗器(KQ-300B，昆山超声仪器有限公司)；数控恒温水浴氮吹仪(KL512J，北京康林科技有限公司)；高速冷冻医用离心机(R18型，北京白洋医疗器械有限公司)；高速离心机(ABBOTT，德国)；涡旋混合器(XW-80A，上海医科大学仪器厂)；低温冰箱(MDF-U2086S，日本SANYO)；旋片式真空泵(FY-2C，浙江飞越机电有限公司)；电子分析天平(CPA225D，德国Sartorius)；台式酸度计(HANNA-pH 213，罗马尼亚)。米卡芬净原料药(河北三韵生物科技有限公司，含量99.5%，批号SL20160123)；艾瑞昔布对照品(中国食品药品检定研究院，纯度99.9%，批号161104)；注射用米卡芬净钠(安斯泰来制药有限公司，规格50 mg，批号023590)；厄他培南原料药(石药集团中诺药业有限公司，含量97.0%，批号181512009)；乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司，批号130701)；醋酸铵(分析纯，北京市红星化工厂，批号970225-1)；冰乙酸(分析纯，天津市永大化学试剂有限公司，批号GB/T 676-2007)；高纯氮气(含量99.9%，石家庄京联实用气体有限公司，批号20160307)；蒸馏水(深圳屈臣氏有限公司)。

1.3 米卡芬净测定方法学的建立

1.3.1 检测条件:色谱条件色谱柱：Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.01 mol/L醋酸铵缓冲盐(冰醋酸调节pH值4.5)(42.5:57.5，V/V)；流速：1.0 ml/min；检测波长：269 nm；柱温：30℃；进样量：10 μl；内标：艾瑞昔布。

1.3.2 溶液配制:①米卡芬净对照品溶液：精密称量米卡芬净对照品适量，用蒸馏水溶解，得浓度为4 mg/ml 的米卡芬净储备液，4℃保存待用。取米卡芬净储备液适量，精密量取，置量瓶中，蒸馏水定容，得浓度依次为10、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1 000、2 000 mg/L的系列对照品溶液。②内标溶液：精密称量艾瑞昔布对照品适量，蒸馏水溶解，得浓度为400 mg/L的内标储备液；精密量取艾瑞昔布贮备液适量，用蒸馏水稀释成200 mg/L的内标溶液，4℃保存待用。

1.3.3 血浆样品处理:取血浆样品100 μl，置1.5 ml离心管中，加内标溶液10 μl，加乙腈400 μl沉淀蛋白，涡旋混合1 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液10 μl进样测定。

1.3.4 专属性:取米卡芬净对照品溶液、内标溶液分别进样，记录色谱图；分别取空白血浆、血浆样品各100 μl，按“1.2.3”项下处理方法处理(其中空白血浆不加内标)进样并测定。

1.3.5 最低检测限和最低定量限:配制一定浓度的模拟血浆样品100 μl，按“1.2.3”项下方法处理并测定。以倍比稀释法配制并依次进样测定。

1.3.6 标准曲线的绘制:吸取米卡芬净系列标准溶液10 μl于1.5 ml离心管中，氮气吹干，分别加入空白血浆100 μl，配制成浓度为1、1.56、3.13、6.25、12.5、25、50、100、200 mg/L的模拟血浆样品。按“1.2.3”项下方法处理，进样测定，记录米卡芬净和艾瑞昔布峰面积。以峰面积比为纵坐标，米卡芬净血浆浓度为横坐标，绘制标准曲线，回归标准曲线方程。

1.3.7 准确度试验

1.3.7.1 绝对回收率：取空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备成米卡芬净浓度为低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)三种浓度的模拟血浆样品，按“1.2.3”项下方法处理并分析，记录米卡芬净和艾瑞昔布峰面积；另取等量的米卡芬净对照品溶液和艾瑞昔布对照品溶液分别进样测定，记录峰面积；模拟血浆样品中米卡芬净峰面积与进样等量对照品溶液所得峰面积的比值，即为米卡芬净的绝对回收率；模拟血浆样品中艾瑞昔布峰面积与等量对照品溶液进样所得峰面积的比值，即为内标绝对回收率。

1.3.7.2 相对回收率：取空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备成米卡芬净浓度为低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)三种浓度的模拟血浆样品，按“1.2.3”项下方法处理并分析，根据标准曲线方程计算米卡芬净浓度，该浓度与理论浓度的比值即为相对回收率。

1.3.8 精密度试验:取空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备成米卡芬净浓度为低(1.5 mg/L)、中(25 mg/L)、高(160 mg/L)的模拟血浆样品，于1 d内处理并测定，计算RSD，考察日内精密度；连续5 d制备、处理并测定，计算RSD，考察日间精密度。

1.3.9 稳定性试验

1.3.9.1 反复冻融稳定性：取空白血浆6份，制备成米卡芬净浓度为25 mg/L的模拟血浆样品，分为2组，每组3份。一组即刻处理后测定，一组反复冻融3次后处理后测定，考察米卡芬净血浆样品反复冻融稳定性。

1.3.9.2 低温保存稳定性：取空白血浆6份，制备成米卡芬净浓度为25 mg/L的模拟血浆样品，分为2组，每组3份。一组即刻处理后测定，一组于-40℃保存14 d后处理并测定，考察米卡芬净血浆样品低温保存稳定性。

1.3.9.3 处理血浆样品放置稳定性：取空白血浆3份，制备成米卡芬净浓度为25 mg/L的模拟血浆样品，按“1.2.3”项下方法处理后4℃放置0、4、24 h后进样测定，考察米卡芬净血浆样品处理后放置稳定性。

1.4 药动学研究

1.4.1 给药方案与血浆样品处理:米卡芬净注射液的配制：取注射用米卡芬净钠1支(标示量50 mg)，用0.9%氯化钠溶液10 ml溶解，配成5 g/L的米卡芬净溶液，每次新鲜配制。

1.4.2 厄他培南注射液的配制：取厄他培南原料药粉末约360 mg，溶于12 ml 0.9%氯化钠溶液中，得到浓度约为30 g/L的厄他培南溶液，每次新鲜配制。

1.4.3 给药方案:取SD雄性大鼠40只，随机分为对照组和试验组，每组20只。试验组依次尾静脉注射厄他培南溶液(相当于100 mg/kg厄他培南)和米卡芬净注射液(相当于15 mg/kg米卡芬净)；对照组依次尾静脉注射等量0.9%氯化钠溶液和米卡芬净溶液(相当于15 mg/kg米卡芬净)。分别于给药后2、10、20、30 min和1、2、4、6、12、24 h于眼内眦取血0.5 ml，置于肝素钠抗凝离心管中，10 000 r/min离心5 min，取上层血浆，-40℃冰箱保存待测。

1.4.4 血浆米卡芬净浓度测定:待测血浆室温解冻，按照“1.2.3”项下血浆样品处理方法处理并测定，根据标准曲线方程计算血浆米卡芬净浓度。

1.5 统计学分析 采用DAS2.1.1软件对每只大鼠血浆中米卡芬净浓度-时间数据进行统计矩拟合，权重为1/cc，并计算米卡芬净主要药动学参数。应用SPSS 13.1统计学软件依次将试验组与对照组大鼠间主要药动学参数进行统计学分析，若进行比较的2组均服从正态分布，则采用两个独立样本的t检验；若其中有一组不服从正态分布，则选用非参数检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 方法学验证

2.1.1 专属性、最低检测限和最低定量限:内源性杂质不干扰米卡芬净和内标的测定。以S/N≥10时的血浆药物浓度作为最低定量限，以S/N≥3时的血浆药物浓度作为最低检测限。见图1。

图1 HPLC图

2.1.2 标准曲线和线性范围:计算得到标准曲线方程为Y=0.0443 X-0.0025，r2=0.9994(n=9)，表明米卡芬净在1.0～200 mg/L范围内的线性关系良好。见图2。

2.1.3 准确度：①绝对回收率：低、中、高三种浓度米卡芬净模拟血浆样品的绝对回收率依次为99.10%，90.10%和95.00%，RSD值依次为4.0%，4.9%和3.7%；内标绝对回收率为97.70%，RSD值为4.3%。②相对回收率：低、中、高三种浓度米卡芬净模拟血浆样品的相对回收率依次为101.7%，108.4%和103.8%，RSD值依次为6.0%，6.7%和7.7%。见表1、2。

2.1.4 精密度:低、中、高三种浓度米卡芬净模拟血浆样品的日内精密度的RSD值依次为6.3%，7.9%和7.7%；日间精密度RSD值依次为8.4%，8.9%和8.6%。见表3、4。

2.1.5 稳定性试验:米卡芬净模拟血浆样品即刻处理后测定和反复冻融3次后处理并测定，其RSD分别为3.1%和1.6%。且反复冻融3次后处理测得浓度为即刻处理后测得浓度的95.41%。米卡芬净模拟血浆样品即刻处理和-40℃保存14 d后处理，其RSD分别

图2 大鼠血浆中米卡芬净标准曲线

表1 大鼠血浆中米卡芬净的绝对回收率 n=5

表2 相对回收率实验 n=5

表3 日内精密度实验 n=5

表4 日间精密度实验 n=5

为4.0%和3.9%。保存14天后处理测得浓度为即刻处理测得浓度的95.62%。米卡芬净模拟血浆样品处理后即刻进样测定与4℃放置0、4、24 h测定的RSD为7.5%。结果表明血浆样品处理后4℃放置稳定性良好，满足实验要求。见表5、6。

表5 反复冻融稳定性 n=3

表6 -40℃保存14 d稳定性实验 n=3

2.2 药动学结果 药动学参数与对照组相比，除了Cmax(P<0.05)，试验组AUC0-24h、AUC0-∞、t1/2、CL和V差异均无统计学意义(P>0.05)。结果表明，合用厄他培南前后大鼠体内米卡芬净的药代动力学受到较小影响。见表7，图3。

表7 日间精密度实验

图3 2组大鼠体内米卡芬净的平均药时曲线

3 讨论

本实验采用艾瑞昔布作为内标进行HPLC法测定大鼠血浆中米卡芬净的浓度。在流动相选择方面，从乙腈-水体系、甲醇-水体系、乙腈-醋酸盐体系、甲醇-醋酸盐体系中选择，比较后发现乙腈-醋酸铵作为流动相时的被测物和内标物分离度以及峰形良好，满足实验要求。

血浆样品处理方法选取蛋白沉淀法。本实验考察了甲醇和乙腈2种有机溶剂,结果乙腈的蛋白沉淀效果与甲醇相近,但使用甲醇时会产生溶剂化效应,导致色谱峰加宽。鉴于本研究流动相为乙腈-醋酸铵，因此采用乙腈为蛋白沉淀剂。综上，此HPLC法专属性强、精密度好、准确度高，可用于测定大鼠体内米卡芬净血药浓度。

由于药物在血液中存在多重平衡，例如，游离药物与血浆蛋白结合药物的平衡、游离药物与组织药物的平衡以及游离药物和血细胞内药物的平衡等；厄他培南与米卡芬净合用后，米卡芬净血浆Cmax降低，但是其余参数几乎不变，根据得到的药动学参数和药时曲线，由此可以认为厄他培南对米卡芬净的药动学基本无影响。

另据文献报道，血液中可结合的白蛋白数量减少会导致血细胞内米卡芬净药物浓度的增大[13]，即加速了米卡芬净从血浆转移至血细胞内的过程。可推测，由于厄他培南的血浆蛋白结合率很高，先于米卡芬净占据了大部分白蛋白，因此造成了米卡芬净进入血液后只有很少的白蛋白可以结合的情况，从而造成更多的游离米卡芬净向血细胞内转移，而游离血药浓度的升高也会加速药物进入其他组织部位。Petraitis等[14]，也得到类似的实验结果，米卡芬净与拉夫康唑合用使得拉夫康唑Cmax上升而其余药动学参数未改变，遗憾的是他们并未对此作出解释或推测。考虑到以上问题，有必要深入研究厄他培南对米卡芬净相互之间蛋白结合力的强弱以及在人血浆中的情况，为米卡芬净人体内药动学研究提供更多的理论依据进而为临床用药提供参考。

综上所述，本次实验所建立的HPLC法可准确快速测定大鼠血浆中的米卡芬净药物浓度。厄他培南与米卡芬净合用后，由于米卡芬净在血液中存在游离型与结合型的相互转化以及血细胞内外的药物浓度变化使得厄他培南对米卡芬净的药动学影响很小。