23 个轴前性多指家系临床及基因分析

孙丽颖 黄盈棹 田文 钟文耀 殷悦涵 张楠 杨勇 郭阳 李斌 赵俊会

手部轴前性多指 ( preaxial polydactyly，PPD )，又称桡侧多指，是一种常见的先天性手部畸形，其在活产婴儿中发生率为 0.08～1.4 / 1000，约 20% 为双侧畸形，其中最常见者为多拇畸形[1]。多数为散发病例，但也可见于家族遗传，尤其是伴有三节指骨拇的 PPD 多有遗传倾向[2-4]。有研究提示约有 100种基因与多指相关[5]，在非综合征性的 PPD 中，目前研究提示 sonic hedgehog (SHH) 基因、肢体极化区增强调节序列 ( the zone of polarizing activity regulatory sequence，ZRS ) 基因、GLI 家族锌指 3 ( GLI family zinc finger 3，GLI3 ) 等基因也与之有关[5-7]，但突变位点多样，且具体致病机制尚不明确。另外该畸形也可为某些罕见的综合征表型之一，如范可尼贫血( Fanconi's anemia )，Holt-Oram 综合征和 Rubinstein-Taybi 综合征等[1]，也多与特定基因突变有关。因此，对该类患者进行遗传学检查，有助于从根本上认识该类畸形的发生及发展，尤其是针对综合征性患者，更有助于早期全面诊断、综合治疗及后续遗传咨询。故在获得患者及其监护人的充分知情同意下，对 23 个先天性 PPD 家系进行临床表型及遗传学分析。

资料与方法

一、临床资料

本研究纳入 23 个 PPD 家系，先证者均为 2018年 4 月至 2019 年 12 月，在我院就诊者 ( 连续病例 )，年龄 1～14 岁，平均 ( 3.0±2.0 ) 岁。男 10 例，女 13 例。双侧多拇指畸形 7 例，右侧 7 例，左侧9 例。23 名先证者均常规查体并行双手 X 线、胸部正位 X 线、心脏彩超及腹部彩超等术前常规检查，并进行家系调查 ( 表1 )。

二、本研究经北京积水潭医院伦理委员会批准；患者监护人签写知情同意书。

三、全外显子组测序

先证者及其父母的外周血样本每人 2～3 ml，通过 Dneasy Blood & Tissue Kit ( Qiagen ) 试剂盒提取基因组 DNA。采用 Aglient V5 芯片进行外显子组捕捉，并在 Illumina HiSeq 4000 仪器进行二代高通量测序。当测序数据满足平均测序深度约 100X，20X序列比例＞97% 及 Q30＞85% 等质控指标后方可用于后续分析。测序片段数据通过 Burrows-Wheeler Aligner 与 GRCh 37 ( Genome Reference Consortium Human Reference 37 ) 参考基因组进行比对，比对所得变异经 VEP ( Variant Effect Predictor ) 软件进行注释。在进行临床遗传分析前，变异列表将依据 OMIM( Online Mendelian Inheritance in Man ) 和 gnomAD ( The Genome Aggregation Database ) 等遗传性疾病数据库及人群大规模测序数据库，结合人类表型标准术语( Human Phenotype Ontology，HPO ) 对变异进行分类及筛选[8]，剔除与临床表现明显无关的变异及人群中常见的高频变异 ( 等位基因频率 3% 以上 )。针对具体变异的临床遗传评级参考美国医学遗传学与基因组学学会 ( The American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG ) 发布的序列变异解读标准和指南进行分类[9]。该指南综合考量了人群频率证据、计算机算法预测类证据、功能学研究证据、家系遗传类证据 ( 共分类、新发变异等 ) 及其它数据库评级信息等各类证据，并依据证据强度及类型进行权重评估，最终将不同权重的证据叠加并依据其指定的标准公式得出变异评级。本研究所纳患者的测序数据中，经过初筛的变异均按照该指南进行致病性评估，并因此分别被归入致病变异、疑似致病变异、临床意义未明、疑似良性变异、良性变异等五个层级中。对于致病变异、疑似致病变异及临床意义未明的变异，其报告与否将进一步结合患者的临床表型、遗传信息进行综合判断，以对临床工作进行充分提示。所有本研究报告的临床变异均在对应受检者的样本中经一代测序 ( Sanger 验证 ) 验证。

四、基于全外显子组测序的拷贝数变异分析

利用 100 个独立外显子组测序数据作为内部控制。利用 GATK 从出 BAM 文件中读取深度信息，并且过滤掉测序深度低于 10X 的部分。经过筛选后，利用算法分析每个样本的测序深度信息以及Z-score。拷贝数变异通过 Z-score 分析并且人工分析 BAM 文件中的特定区域。

五、实时荧光定量 PCR

对家系 23 ( 图1 ) 及一健康者血样，进一步采用荧光聚合酶链式反应 ( Quantitative Real-time PCR )进行验证。本研究使用 SYBR®Green PCR Master Mix( Applied biosystem ) 试剂。PCR 过程按照制造商提供的操作指南进行。本研究所涉及的三对引物序列如下：

ZRSin-F：CACCAGAACCAGGCCAAATA；

ZRSin-R：GAGTAGGAAGTCCAGCCTCT；

ZRSout-F：CACCAGCACAGAACTCTTCG；

ZRSout-R：CCAAACCATCCAGACATCCC；

β-actin-F：GACCTCTATGCCAACACAGT；

β-actin-R：AGTACTTGCGCTCAGGAGGA。

每个反应的 ΔΔCT 用来计算相对的拷贝数变异。

结 果

一、Temtamy-McKusick 分型

23 名先证者，共 30 侧患肢，以 Temtamy-McKusick 分型，PPD I～IV 型分别为 PPD1 ( 21 /30 )、PPD2 ( 7 / 30 )、PPD3 ( 0 / 30 ) 和 PPD4 ( 2 / 30 )( 表1 )。

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二、单纯型和综合征型

23 名先证者中，表现为单纯性 PPD 者 18 例，合并其它畸形者 5 例，包括：3 例合并心脏畸形，其中 1 例除心脏畸形另合并血液系统异常；1 例合并肾脏畸形；1 例合并耳廓畸形及先天性甲状腺功能减退 ( 表1 )。

三、家系调查结果

23 个家系中 15 个家系伴有家族史 ( 65% )，其中 11 个家系 ( 除先证者，其余患者 ) 同为复拇指畸形，包括父亲 ( 3 / 11 )、母亲 ( 3 / 11 )、同父母子女( 2 / 11 )、同父异母子女 ( 2 / 11 )、父系家庭二级亲属 ( 3 / 11 )、母系家庭二级亲属 ( 1 / 11 )；另有 4 例为父系或母系亲属的足部畸形，其中 3 例为足多趾畸形，1 例为第一足趾屈曲内收畸形 ( 表1 )。

四、基因检测结果

先证者 17 ( 图2 ) 经全外显子测序发现 SALL1( Spalt Like Transcription Factor 1，SALL1 ) 突变NM_002968.2:c.2712_2715 del (p.Gly906Valfs*59)为杂合突变，经 Sanger 验证 ( 图3 ) 该变异来源于其患者的父亲，其父亲临床表型为手拇指多指畸形和耳廓发育不良。此变异在公共数据库 gnomAD 中频率为 0，同时此突变预测会造成 SALL1 阅读框改变，根据美国医学遗传学会指南，此突变分类属于致病变异。此患者临床表现为拇指多指、皮疹、耳位低、耳廓发育不良 ( 双侧耳廓向外凸出，上耳廓过度折叠 )，甲状腺功能减退和发育迟缓，符合Townes-Brocks 综合征的诊断标准。

图1 先证者 23 及其父亲手部表型；先证者手部 X 线片图2 先证者 17 体征：桡侧多指、耳阔发育不良Fig.1 Phenotype of proband 23 and her father; X-ray image of the probandFig.2 Phenotype of proband 17: thumb duplication with protruding ears, over-folding of superior helices

家系 23 为一单纯性 PPD 家系 ( 图4 )，表现为双侧拇指多指、三节指骨拇及中环小指并指。全外显子组测序在外显子层面未发现可以解释患者家族表型的点突变，但通过给予全外显子组测序的拷贝数变异分析发现先证者 23 及其父在 7q36.3 ( Chr7:156,318,090-156,911,633 ) 存在杂合性扩增，此区域包含 ZRS。通过实时荧光定量 PCR 验证发现，此扩增在患者及父亲中存在，但在先证者母亲及健康对照未见 ( 图5 )。同时，既往有包含 ZRS 的杂合性扩增导致 PPD 合并并指的家系报道。因此，认为此家系中的 ZRS 杂合性扩增是导致先证者及其父亲异常表型的原因。

图3 家系 17 的 Sanger 验证：1-先证者；2-先证者之父；3-先证者之母Fig.3 Sanger sequencing results of family 17: 1-proband;2-proband's father; 3-proband's mother

图4 III-2 ( 先证者 )，II-3 及 III-1 为家系 23 的 3 位患者Fig.4 Pedigree of family 23. III-2 was the proband

先证者 19 除表现为多指畸形外，还表现为双手拇指发育不良，并发有心血管系统、血液系统异常，临床疑诊为范可尼贫血 ( Fanconi anemia )。全外显子组测序发现先证者携带有FANCI( Fanconi anemia complementation group I ) 复合杂合突变FANCI:c.3662del (p.Lys1221Argfs*3) 和FANCI: c.3006+3A>G(p.?)。此突变分别来自于先证者的母亲及父亲。FANCI: c.3662del (p.Lys1221Argfs*3) 为一移码突变，预测造成蛋白质功能丧失。FANCI:c.3006+3A>G(p.?) 突变为一靠近内含子外显子交界区域的突变，可能会影响 RNA 的剪切，进而影响蛋白质功能。通过 Human Splicing Finder (http://www.umd.be/HSF/) 进行预测 ( 图6 )，此突变会破坏剪接供体，很大可能影响 RNA 剪接，进而影响蛋白质功能。但是，由于无直接证据证明 RNA 剪接受到影响，此突变仍然被定义为临床意义未明突变。

另于家系 1、3、5、15 分别发现KCNH1( Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily H Member 1，KCNH1): c.2426 C>T (p.Pro809Leu)；BMPR1B( Bone Morphogenetic Protein Receptor Type 1B，BMPR1B): c.1503dup (p.Leu502Thrfs*8)；CITED2( Cbp/P300 Interacting Transactivator With Glu/Asp Rich Carboxy-Terminal Domain 2，CITED2): c.533G>T(p.Gly178Val) 和C2CD3( C2 Domain Containing 3 Centriole Elongation Regulator，C2CD3): c.441dup(p.Thr148Tyrfs*8)。但由于缺乏家系样本信息或证据不足，这些突变被分类为临床意义未明的突变。

图5 ZRS 区域与邻近区域的相对拷贝数。HD：健康对照。2 位患者 III-2 及 II-3 中 ZRS 区域相对拷贝数约为 1.5，而 2 位健康人中相对拷贝数约为 1Fig.5 The relative copy number of ZRS region and adjacent region.HD: healthy control. The relative copy number of ZRS region in two patients III-2 and II-3 was about 1.5, while that in two healthy people was about 1

图6 Human splicing finder 网站针对剪切突变预测结果Fig.6 Prediction results of shear mutation on human splicing finder website

于先证者 2 和 10 分别检测出RYR1( Ryanodine Receptor 1，RYR1): c.12242C>T (p.Thr4081Met) 及BRCA2: c.6440_ 6443del (p.His2147 Leufs*20)。RYR1: c.12242C>T (p.Thr4081Met) 突变既往在HGMD( Human Gene Mutation Database ) 数据库中已报道。BRCA2(Breast Cancer genes 2，BRCA2): c.6440_6443del (p.His2147 Leufs*20) 为一移码突变，预测对蛋白质功能有较大影响。但由于这两个突变与患儿的手部畸形无关，因此这两个突变被定义为二级发现 ( Secondary findings ) (表2 )。

讨 论

手部的 PPD 主要为拇、示指的多指、多并指及三节指骨拇指畸形，其中以拇指的多指畸形最为常见，后者临床上多采用 Wassel 分型[10]，即根据多指出现的骨骼位置不同及是否合并有三节指骨拇指而细分为 7 个亚型。而从多指出现的病理生理机制与胚胎发育的关系等角度认识该畸形，则 Temtamy-McKusick 分型[11]更具价值。研究认为多指畸形发生于上肢前后轴 ( 桡、尺侧轴 ) 分化过程中，因内外环境的影响引起信号传导异常，进一步导致手指的形态及数量发生改变[12]，因此从胚胎发育的角度，多指畸形分为 PPD 和轴后性多指。Temtamy 和McKusick[11]将 PPD ( 趾 ) 分为 4 个亚型，PPD1 型为拇指 ( 趾 ) 的多指 ( 趾 ) 畸形；PPD2 型包括三节指骨拇指畸形 ( triphalangeal thumb，TPT ) 以及三节指骨拇指合并桡侧多指、多并指 ( 以中、环、小指并指为主 ) 畸形 ( TPT-polysyndactyly syndrome，TPTPS )；PPD3 型为示指的多指畸形，此型最为少见；PPD4 型则为拇指多指畸形合并并指畸形，多以中环指并指为主。本研究 23 名先证者，共 30 侧患肢，以 PPD1 型为主，其次为 PPD2 型，此两型主要为SHH / ZRS基因异常或该信号通路出现异常所致[12]。

SHH主要介导肢体前后轴的分化，其位于上肢芽后部，即肢体极化区 ( the zone of polarizing activity，ZPA ) 内，SHH在 ZPA 内表达受 ZPA 增强调节序列，即ZRS的控制[12]。ZRS的点突变[2,4,13]和扩增[14-15]均可导致 PPD 的发生，至今已有 20 余种点突变被报道[12]，但关于ZRS杂合性扩增的报道较少[16]。本研究先证者 23 为 PPD2 型，属于 TPTPS，该综合征罕见。该患者与其父在 7q36.3 (Chr7:156,318,090-156,911,633) 区域存在杂合性扩增，此区域包含ZRS，本研究结果再次确认了ZRS区域异常会导致SHH信号的错误表达进而引起 TPT-PS。

表2 变异信息汇总Tab.2 Summary of gene variations

也有研究提示SHH的表达具有时间和剂量的依赖性[17]。异位SHH信号在枝芽发育过程中所表达的强度和持续时间将决定 PPD 的严重程度。Lam 等[17]通过在鸡的胚胎枝芽中加入平滑激动剂( smoothened-agonist，SAG ) 和维甲酸 ( retinoic acid )使枝芽内产生异位SHH，从而出现 PPD 以及前臂畸形，包括桡侧发育不良，作者推论 PPD 和桡侧发育不良的发生可能存在共同的信号通路。本组病例先证者 19，为 PPD1 型合并桡侧发育不良，支持 Lam的假说。该患儿为一携带FANCI基因突变的复合杂合子，FANCI: c.3662del (p.Lys1221Argfs*3) 来源于母亲，FANCI: c.3006+3A>G(p.?)** 来源于父亲。突变导致的范可尼贫血为一隐性遗传病，该突变的分布符合遗传模式。虽然该剪接突变尚不能定为致病变异，但患儿手部、心脏畸形、生长发育滞后及血液系统异常等表型支持范可尼贫血诊断，同时经过软件预测发现此突变很有可能影响 RNA 剪切。后续须进一步试验验证患儿细胞中 RNA 的剪切状态，以明确其诊断。

先证者 17 经全外显子测序发现SALL1基因突变，SALL1蛋白是细胞内转录因子，通过与 DNA的特定区域结合来发挥其活性[18]。SALL1基因突变可导致该蛋白异常变短，引起细胞内功能紊乱。SALL1基因突变可导致 Townes-Brocks 综合征1 型[18-20]( Townes-Brocks Syndrome 1，TBS1，MIM:107480 )。该综合征极为罕见，有文献[19]报道该病发病率预计为 1 / 250000，其主要表现为以肛门闭锁、耳发育不良 ( 如耳轮畸形、耳前耳赘、听力受损等 )、拇指畸形 ( 如拇指三节指畸形、拇指多指畸形等 ) 三联征[18]。多数患者合并至少两种体征，其它常见次要特征包括肾功能不全 ( 伴或不伴肾脏结构异常，如轻度肾扭转不良、异位肾、马蹄肾、肾发育不全、多囊肾、膀胱输尿管返流等 )、先天性心脏病、足部畸形等。少数患者还存在智力障碍、虹膜缺损以及生长发育落后等，也偶有报道合并先天性甲状腺功能减退者[19]。本研究报告了因SALL1基因突变所致 Townes-Brocks 综合征 1 型 1 例，为综合征性 PPD，且该患儿合并先天性甲状腺功能减退罕见，且该变异未曾在既往文献中报道。基于 Lam 的研究，对于综合征性的 PPD，尽管有已知特定的致病基因，但最终是否也是因为产生异位SHH信号所致，还是通过其它信号通路诱导PPD发生，还须进行进一步的动物试验及功能试验研究。

本组研究中先证者 2 和 10 分别检测出RYR1:c.12242C>T (p.Thr4081Met) 及BRCA2: 6440_ 6443del(p.His2147L eufs*20)。前者既往在患有恶性高热的患者中已报道。恶性高热[21]是一种具有家族遗传性的亚临床肌肉病，主要是由吸入麻醉药和琥珀胆碱所触发的骨骼肌异常高代谢状态。临床表现为全身肌肉痉挛，体温急剧升高，酸中毒，可导致多器官功能衰竭甚至死亡，发病凶险，如果不能及时诊断及处理，可危及患者生命。该名患儿术前行基因检查提示存在热性高热易感性，因此术前麻醉评估及准备充分，通过选择不同的麻醉药物有效的避免恶性高热的发生。另 1 例患儿发现BRCA2基因突变，虽然目前患儿家庭尚无乳腺癌或其它癌症的表现，但是此发现有助于肿瘤的早发现、早治疗，极大的改善预后。

通过本组病例遗传学检测，发现ZRS杂合性扩增所致的非综合征性 PPD 1 例及SALL1基因突变导致 Townes-Brocks 综合征，即综合征性 PPD 1 例。笔者认为桡侧多指为手部常见畸形，临床诊断多不复杂，但一定要全面查体，减少综合征性多指的漏诊，误诊。再者对于肢体先天畸形患者，因基因异常可能性大，且可伴有多系统病变，应尽早进行遗传检测，以便明确诊断，综合治疗，同时有利于日后遗传咨询。