丹参酮ⅡA对大鼠脑缺血后PTEN-PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

徐 璇，汤其强

PTEN蛋白是10号染色体上的磷酸酶，是胞内磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的初级磷酸酶[1]，通过降低PI3K的磷酸化，减少信号通路蛋白激酶B(protein kinase B，PI3K)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的表达，参与细胞的增长、分化等多种功能[2]。研究[3]表明PTEN蛋白在脑缺血损伤后氧化增加，导致自噬通路PI3K/AKT/mTOR表达的增强，从而加重脑损伤。减少PTEN蛋白的氧化，对脑组织的保护具有重要意义。故寻找抑制PTEN氧化的新型药物至关重要。丹参酮ⅡA(tanshinone ⅡA，TSA)是植物丹参的提取物，具有活血化瘀、清除氧自由基等功效，在临床上常作为心脑血管疾病患者的治疗用药[4]。研究[5]表明TSA具有明确的调节自噬通路PI3K/AKT从而保护脑组织的作用。但是TSA对PTEN/PI3K信号通路的调节暂无研究。该研究拟探讨TSA调节PTEN对大鼠脑缺血后自噬通路PI3K/AKT/mTOR的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料TSA购自美国Selleck公司，配比浓度为10 mg/kg[6]，术前连续灌胃4 d；6月龄健康雄性SD大鼠共80只，体质量230～280 g，购自济南朋悦实验动物繁育有限公司，标准饲养条件下喂养。PTEN(9188T)、AKT(4691T)、mTOR(3983T)抗体购自美国CST公司；PI3K(ab151549)抗体购自美国Abcam公司,浓度均为1 ∶1 000。

1.2 方法

1.2.1实验分组 随机将SD大鼠分为假手术组(10只)和手术组(70只)。假手术大鼠作为对照组标记为NC组；手术组大鼠再进行随机分两组，即给TSA药组(TSA组)和给生理盐水组(MCAO组)。根据大鼠拔线天数(1、3、7 d)不同，分别将手术组中TSA组第1天标记为T1，第3天标记为T3，第7天标记为T7;MCAO组分别对应为M1、M3、M7。

1.2.2脑缺血模型 根据Longa et al[7]线栓法制作大鼠脑缺血模型。手术操作简述：10%水合氯醛麻醉，在大鼠颈部正中线处切1～2 cm切口，分离出大鼠右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎颈外动脉远心端。从颈外动脉近颈总动脉分叉处切一小口，插入鱼线，鱼线至颈内动脉深入距约2 cm感觉有阻力时，即已插至大脑中动脉，阻断中动脉血流，达成栓塞条件。在栓塞2 h后拔鱼线。根据不同组的要求，在拔线后1、3、7 d进行断头取脑。

1.2.3行为学评分 参照Longa et al[7]方法进行评分：0分：活动正常、无任何神经功能异常者；1分：不能完全伸展左侧前爪者；2分：爬行见向左侧追尾转圈；3分：行走见身体向左侧倾倒、偏瘫；4分：不能自发行走且有意识障碍；纳入者为1～3分。

1.2.4免疫组织化学 取完整脑组织，石蜡包埋，切片。用30 %过氧化氢封闭内源性过氧化物酶；山羊血清封闭非特异性蛋白；孵抗体；DAD显色；复染、脱水、透明、封片。

1.2.5Western blot 断头取脑，选择梗死侧脑组织进行彻底匀浆提蛋白，确保组织完全裂解后收集上清液，即蛋白总溶液。配制SDS-PAGE电泳、上样、转模、孵抗体，曝光后将图片存档，用ImageJ软件分析。

2 结果

2.1 Longa评分对造模成功的大鼠，根据Longa评分，对纳入统计的TSA组和MCAO组大鼠的行为学进行评分统计。通过观察对手术组大鼠的行为评分，从而间接表达大鼠神经功能受损情况。其中TSA组大鼠的行为学评分较MCAO组低(F=89.76，P<0.05)，且差异有统计学意义。见图1。

图1 各组大鼠的行为学评分情况

2.2 免疫组化检测各蛋白表达水平免疫组织化学切片染色显示：与NC组比较，手术组的各蛋白表达水平明显改变：PTEN减少，PI3K、AKT、mTOR表达水平增加，随着时间变化逐渐恢复；手术组中TSA组的PTEN表达增加，PI3K、AKT、mTOR表达降低。见图2。

2.3 Western blot检测各蛋白的表达与NC组比较，MCAO组PTEN蛋白表达减少，PI3K、AKT、mTOR表达增加，差异有统计学意义,与MCAO组比较，TSA组PTEN蛋白表达增加，PI3K、AKT、mTOR表达降低，第1天最明显，差异有统计学意义(FPTEN=79.829,FPI3K=77.423,FAKT=42.400,FmTOR=27.896,P<0.05)，见图3。

3 讨论

随着研究的不断扩展，研究者发现PTEN蛋白在神经领域也不断出现[8-9]：PTEN对神经细胞及脑组织的再生有影响，且PTEN蛋白的表达增加对缺血损伤后的组织具有保护作用。在脑缺血后激活自噬通路PI3K/AKT/mTOR，能够加重脑组织的损伤，但是关于自噬信号的激活机制目前说法不一。随着对蛋白PTEN的研究逐步加深，发现PTEN蛋白具有磷酸酶活性，能够促进PI3K的磷酸化，能够调节自噬通路的表达，对信号通路PI3K/AKT/mTOR具有重要的调节作用。本研究中，在大鼠发生脑缺血后，PTEN蛋白的表达减少，尤其是第1天较为明显，随时间变化逐渐回升，而自噬蛋白PI3K/AKT/mTOR通路蛋白的表达明显增加，在第1天出现峰值，随着时间延长，蛋白表达水平逐渐恢复正常，差异有统计学意义；这一实验结果表明在大鼠发生脑缺血后，机体PTEN蛋白的表达受抑制，从而减少PI3K的磷酸化，激活自噬通路PI3K/AKT/mTOR表达，加重脑组织损伤，验证了脑缺血后PTEN蛋白的氧化能够激活自噬信号通路PI3K/AKT/mTOR，PTEN蛋白具有调控自噬通路PI3K/AKT/mTOR的作用。

图2 梗死侧脑组织细胞免疫组织化学染色 ×200

图3 Western blot 检测各组PTEN、PI3K、 AKT、 mTOR蛋白表达与NC组比较：*P<0.05;与MCAO组比较：#P<0.05

TSA作为临床常用药物，在保护脑缺血方面具有肯定疗效。作为中药，TSA的治疗机制暂无全面了解。前期的研究[4]发现，在大鼠脑缺血发生后，TSA通过调节自噬通路PI3K/AKT/mTOR的表达，减轻脑组织损伤，从而起到护脑的作用。关于TSA如何下调PI3K/AKT/mTOR的表达，目前暂无研究说明。本研究在TSA组的大鼠脑缺血发生后，PTEN蛋白的表达虽然呈下降趋势，但与MCAO组比较，幅度明显小，PI3K/AKT/mTOR蛋白表达的增加趋势较小，再一次验证了TSA有下调自噬信号通路表达的作用。而TSA能够促进PTEN蛋白的表达，从而通过减轻自噬通路PI3K/AKT/mTOR的过度表达，减轻脑缺血后导致的脑组织损伤。再结合大鼠的行为学评分，TSA组的行为学评分较MCAO组低，在手术后第1天明显，且差异有统计学意义(P<0.05)，表明TSA治疗大鼠脑缺血具有临床意义。