有柄石韦对小鼠皮肤伤口愈合及转化生长因子-β1水平的影响*

吴遵秋， 孔祥耀， 黎小梅， 于世博， 唐毅， 陈明翠， 倪稳， 陈良继， 孙见飞

(贵州医科大学 基础医学院 化学与生物化学实验室， 贵州 贵阳 550025)

有柄石韦[Pyrrosiapetiolosa(Christ)Ching，P.petiolosa]在我国分布十分广泛，是一种水龙骨科石韦属下的药用蕨类植物。在传统的中医药学体系中，P.petiolosa具有非常重要的药用价值，其多个部位已经被研究证实并用于治疗如皮肤局部炎症、肾盂肾炎、慢性支气管炎及泌尿系统感染等疾病[1]。皮肤伤口愈合初期的局部炎症反应是伤口愈合的基础[2]，一些具有清热、活血化瘀、解毒及祛腐生肌功效的传统中药被用于治疗皮肤溃疡，其机制与调节细胞的生长和对局部感染的控制、改善皮肤伤口感染局部微环境[3-4]。在贵州民间，常将P.petiolosa常用于治疗皮肤的烧伤、止血、伤口预防感染、加快伤口恢复的金疮药，效果良好[5]，但关于P.petiolosa治疗皮肤伤口愈合作用机制的研究鲜有报告。研究发现，转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)在创伤后皮肤组织中的表达量有所增加，其表达的时程变化与微小血管形成有一定的一致性， TGF-β对皮肤新生血管的形成有一定的影响作用，对促进皮肤伤口愈合也起着重要作用[6]，TGF-β中的TGF-β1主要发挥加快胶原沉积、加速创面愈合来促进病理瘢痕的形成[1]。本研究将P.petiolosa孢子叶粉末水提物用于皮肤全层切除伤的小鼠动物模型，观察用药后不同时点创缘组织TGF-β1的变化，探究P.petiolosa对皮肤伤口愈合的作用及机制，报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 90只健康的SPF级(specific pathogen free，SPF) 雄性小鼠，体质量(20±3)g，购买自贵州医科大学实验动物中心，批号SCXK(黔)2018-001；P.petiolosa采购于贵州本地，经贵州医科大学天然产物化学重点实验室鉴定；云南白药粉末购于贵州医科大学附属医院，苏木精-伊红(HE)染色试剂盒、第二抗体试剂SP-9002试剂盒、DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；TGF-β1 抗体购自上海江林生物科技有限公司。

1.1.2主要仪器 石蜡切片机(德国莱卡RM2015)；低温冰箱(日本三洋MDF-382E型)；离心机(德国Eppendorf-5430)；水平电泳槽DYY-Ⅲ 31D、DYY-5型稳压稳流电泳仪(北京六一)；高速粉碎机(浙江永康市溪岸五金药具厂)；TSJ-SD 电脑自动组织脱水机(江苏省常州市中威电子仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1有柄石韦水提物制备 从有柄石韦叶中刮下孢子粉末，采用100目粉碎机粉碎孢子叶；将有柄石韦孢子与双蒸水以1 ∶10的比例混合，置于水浴箱中，100 ℃ 8 h，得到有柄石韦孢子叶水提液。

1.2.2小鼠皮肤全层切除伤模型构建 90只小鼠适应性饲养3 d后随机均分为空白组，有柄石韦组和云南白药组。所有小鼠均采用腹腔注射麻醉(注射3%戊巴比妥钠)，刮净小鼠背部毛发，利用皮肤活检器和剪刀在每只小鼠的背部脊柱正中做1 cm×1 cm大小的全层皮肤切除伤口制作皮肤全层切除伤模型；造模后云南白药组小鼠给予云南白药粉末处理伤口，有柄石韦组小鼠采用有柄石韦粉末水提物处理伤口，空白组仅给予生理盐水处理3组均连续治疗5 d(1次/d)。各组于手术当日，术后第3、7、14及18天取出2只小鼠，测算伤口缩小比例.每组剩余的20只小鼠分别于给药完成后的第3、7、14及18 天分4批次处死，取创缘周围组织苏木精—伊红 (hematoxylin-eosin，HE)染色观察创缘组织愈合情况。

1.2.3小鼠伤口缩小比例 术后第3、7、14及18 天拍摄伤口面积，参考文献[1]计算创面愈合率，评价伤口恢复的情况。伤口愈合率=[(伤口初始面积-治疗后伤口面积)/伤口初始面积]×100%。

1.2.4创缘组织HE染色 于相应时间点取每组小鼠的创缘组织，处理干净皮肤组织上的毛发，采用10%的中性甲醛固定24 h，常规脱水后，使用二甲苯溶液透明和包埋皮肤组织块；切片厚5 μm并HE染色，在光学显微镜下观察结果[7]。

1.2.5创缘组织的TGF-β1表达 采用Western blot方法，取皮肤创缘组织于RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解缓冲液中裂解。裂解产物在12 000 r/min下离心10 min，收集上清液。用BCA检测试剂盒检测蛋白质浓度。然后负载40 μg蛋白质样品/泳道，进行SDS-PAGE电泳90 min(80 V在浓缩胶中，120 V在分离胶中)。200 mA恒流90 min，用湿式转移法将蛋白质转移到PVDF膜上。将PVDF膜用5%脱脂奶粉在室温下密封2 h，并与第一抗体在4 ℃通宵培养。用TBST清洗3次，10 min/次，在室温下用IgG-HRP 2培养2 h。按照1 ∶1的比例制备ECL化学发光液；然后将PVDF膜放置在曝光板上进行显影和固定，并使用全自动荧光和可见光凝胶成像分析仪进行曝光分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 小鼠伤口缩小比例

结果显示，云南白药组和有柄石韦组小鼠伤口在第3、7、14及18天时的缩小比例均大于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；有柄石韦组在第3、7、14及18天时的伤口缩小比例均小于云南白药组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠术后不同时间点创面愈合率比较Tab.1 Comparison of wound healing rate in different periods of wound

2.2 创缘组织愈合情况

如图1所示，建模后第3天，云南白药组和有柄石韦组小鼠伤口处的肉芽组织较规则且厚实，而空白组小鼠伤口处肉芽组织显得菲薄和不规则；建模后第7天，云南白药组和有柄石韦组小鼠伤口处的肉芽组织继续生长、相比第3天厚度有所增加、较为紧凑、无水肿现象，而空白组小鼠伤口处相对无明显变化；建模后第14天时3组的变化则更明显，建模后第18天，则3组的伤口基本愈合，与空白组相比，云南白药组和有柄石韦组的愈合后的组织在镜下显得更为紧致、无水肿现象、且出现较多的毛囊和皮脂腺。

图1 术后第3、7、14及18天时各组小鼠皮肤创缘组织愈合情况(HE, ×400)Fig.1 Results of HE staining of skin wound tissues of mice in each group on the 3rd, 7th, 14th, and 18th days after operation(HE, ×400)

2.3 皮肤创缘组织的TGF-β1蛋白表达

如图2所示，建模后第3天时，TGF-β1蛋白表达水平开始升高，第7天时到达峰值，第14天开始有明显下降趋势。第3、7及14天时，云南白药组与有柄石韦组的TGF-β1蛋白的相对表达量均较高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；第18天时，3组小鼠创缘组织TGF-β1蛋白比较差异无统计学意义(P>0.05)。

注：1～3泳道为第3天，4～6泳道为第7天，7～9泳道为第14天，10～12泳道为第18天，1、4、7及10泳道为空白对照组，2、5、8及11泳道为有柄石韦组，3、6、9及12泳道为云南白药组；(1)与空白对照组比较，P<0.05；(2)与有柄石韦组比较，P<0.05。图2 术后第3、7、14及18天时各组小鼠皮肤创缘组织TGF-β1蛋白表达Fig.2 Expression level of TGF-β1 protein in the skin wound tissue of each group on the 3rd, 7th, 14th, and 18th days after operation

3 讨论

研究发现，伤口的愈合是一个涉及多细胞参与的过程，包括角质细胞、成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞和血小板等的共同作用，这些细胞对TGF-β都有很高的反应性[7-8]。TGF-β参与了皮肤愈合的炎症期、肉芽组织期和瘢痕形成期全过程[9-12]。血小板脱颗粒释放至创缘，在TGF-β的趋化作用下，单核细胞和中性粒细胞到达伤口，以自分泌方式维持局部浓度。TGF-β也可通过趋化作用于成纤维细胞，刺激纤维黏连蛋白和胶原基因的转录等[13]，通过调节蛋白酶的表达抑制基质降解，促使成纤维细胞转化为肌成纤维细胞，加速伤口收缩[14-15]。虽然有报道称TGF-β不是唯一的促进伤口愈合的生长因子，但至少也是最重要的调控和抑制表皮增殖的因素[16-17]。

研究表明，中药对临床创面的修复都有着一定的效果[4]。云南白药作为我国传统中药，可以显著缩短创口的出血时间及凝血时间[18-19]，被广泛用于治疗临床创伤出血、消化道出血等疾病[20]。在贵州民间，常将P.petiolosa常用于治疗皮肤的烧伤、止血、伤口预防感染、加快伤口恢复的金疮药，使用效果良好[5]，但关于P.petiolosa治疗皮肤伤口愈合作用机制的研究鲜有报告。本研究以云南白药为阳性对照，从TGF-β1的角度对P.petiolosa促进伤口愈合机制进行初步探究。结果表明，云南白药组和有柄石韦组的伤口缩小比例均大于同期空白对照组(P<0.05)。提示云南白药组和有柄石韦组组织中肌成纤维细胞生成迅速，这些细胞产生机械拉力，将创缘向创口中心牵引，促使伤口快速收缩。提示有柄石韦在促进伤口愈合上有积极作用。HE染色下，云南白药组和有柄石韦组的肉芽组织较空白对照组紧致厚实，成纤维细胞和纤维细胞丰富，空白对照组相对菲薄疏松。术后第18天有柄石韦组和云南白药组的切片显示伤口上皮化完全，提示愈合较为完全，愈合程度较好。Western blot结果也显示，建模后第3天时，TGF-β1蛋白表达水平开始升高，第7天时到达峰值，第14天开始有明显下降趋势。第3、7及14天时，云南白药组与有柄石韦组的TGF-β1蛋白的相对表达量均较高于空白对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；第18天时，3组比较差异无统计学意义(P>0.05)。提示有柄石韦组伤口组织TGF-β1分泌量介于空白对照组和云南白药组，利于伤口皮肤愈合的炎症期、肉芽组织期和瘢痕形成期的进行，对促进伤口愈合有积极作用。

综上所述，伤口修复是一种常见的病理过程。本研究结果表明，有柄石韦促进伤口愈合的机制可能是通过刺激TGF-β1的表达使伤口修复的炎症期、肉芽组织期和瘢痕形成期加快，促进成纤维细胞和巨噬细胞的募集，进一步释放更多的生长因子，加速创面再上皮化。促使成纤维细胞转化成肌成纤维细胞，加速创口中心对创缘的牵拉作用，加速伤口的缩小，加速创面愈合。