马勃止血活性部位的筛选研究*

隋 新，李 鹏，谢 洋，付 东，张晓臣

（黑龙江省科学院 高技术研究院，黑龙江 哈尔滨150020）

马勃（Lasiosphaera Calvatia）别名灰包、马粪包，是一类担子菌门的真菌通称，始载于《名医别录》，其干燥子实体可入中药，具有止血、抗菌、抗癌等功效，临床上用于多种出血性疾病，如口腔出血、消化道出血及外伤出血等。自20世纪60年代以来，由于马勃特殊的药理作用，使其倍受医药界的关注。中国药典2005版规定灰包科脱皮马勃、大马勃和紫色马勃的干燥子实体做为药用马勃正品[1]。马勃药材在我国资源丰富，生于旷野草地，产于内蒙、辽宁、安徽、甘肃、江苏、云南等地区[2]。

尽管马勃具有较好的药理作用[3-6]，但大部分研究仅仅是对其中所含的化合物进行提取分离，虽然从中得到了不少种类的化合物，现已证实的有氨基酸[7]、甾类化合物[8]、萜类化合物[9]、马勃多糖[10]、多肽和蛋白质[11,12]，还有一些其它成分如微量元素等，但是对其化合物的药理活性研究较少。因此，本文利用活性物追踪分离的方式，采用体外凝血实验，利用加热回流提取、有机溶剂萃取等方式对马勃中止血活性物质进行分离纯化，最终得到止血活性部位，此研究将为新型药物的开发奠定基础，为马勃资源的合理利用及药用部位的确定提供参考。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂、实验动物与材料

QE-200型高速万能粉碎机（浙江屹立工贸有限公司）；EYEL4型平行反应仪（东京理化器械株式会社）；RE-52型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；FD-2型冻干机（北京博医康实验仪器有限公司）；K61型秒表（上海星钻秒表有限公司）；CS501-SP型水浴锅（重庆四达实验仪器厂）；6孔白陶瓷板（上海垒固仪器有限公司）。

95%乙醇（AR西陇化工股份有限公司）；石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，均为分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；枸橼酸钠（天津市科密欧化学试剂有限公司）；生理盐水（吉林省广春药业有限公司）；蒸馏水（自制）。

健康实验用哈长耳白兔（体质量2.0～2.5kg，雄性，购于哈尔滨医科大学动物实验中心）；云南白药（云南白药股份有限公司，规格：4g，批号：ZDA1602，购于哈尔滨联想亿百大药房连锁有限公司）；马勃药材购于南极药材批发市场。

1.2 实验方法

1.2.1 提取方法 取马勃干燥药材适量，用粉碎机粉碎，溶剂为水、45%乙醇、95%乙醇，固液比1∶15，加热回流提取3次，每次2h，提取结束后过滤得上清液，合并滤液，减压回收溶剂，冷冻干燥，得固形物，称重，计算得率。

1.2.2 萃取方法 按照1.2.1项下提取方法将提取液浓缩至无醇味时停止，按照提取液与溶剂比例为1∶1，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到不同萃取层，减压回收溶剂，冷冻干燥，得固形物，称重，计算得率。

1.2.3 体外凝血实验

1.2.3.1 瓷板针挑法 在白瓷板的凹坑内，分别加入浓度为5mg·mL-1样品0.1mL，再分别加入CaCl2溶液0.1mL，用大头针把药液与CaCl2溶液混匀，最后分别同时加入抗凝血液0.5mL，立即计时，迅速用大头针搅拌混匀且搅拌次数一致。以云南白药为阳性对照，并设空白对照。以后每30s用大头针穿过血液轻挑1次，当出现血丝时为开始凝血，当推动血块时，露出瓷板白底即算血液完全凝固。从加入抗凝血液到血液完全凝固时间为凝血时间。

1.2.3.2 试管法 取内径为8mm，长10cm的玻璃洁净试管，每管分别加入浓度为5mg·mL-1样品0.1mL，再加入CaCl2溶液0.1mL，摇匀，在37℃水浴温浴1min，然后于各管内同时加入兔血0.5mL，以云南白药为阳性对照，并设空白对照，盖紧，倒转3次，立即计时，在37℃的水浴箱中观察，每隔30s轻轻倾斜试管1次，角度为30°，观察血液是否流动，直至倾斜到90°血液不再流动而完全凝固于试管底为止，即为凝血时间。

1.2.3.3 复钙时间测定 取内径为8mm，长10cm的洁净玻璃试管，每管分别加入浓度为5mg·mL-1样品0.1mL，加入的CaCl2溶液0.1mL，摇匀，在37℃水浴温浴1min，再于各管内同时加入0.1mL的血浆，同时开动秒表计时，每隔15s倾斜试管1次，在混合液中开始出现弥漫的白色颗粒纤维蛋白丝时，即为复钙时间。以云南白药为阳性对照，并设空白对照。

1.2.4 统计学方法 实验数据均平行测定3次，数据用平均数±标准差（x±s）表示，采用GraphPad软件进行统计学分析，两组间比较采用两样本t检验，若P＜0.05为差异有显著性，P＜0.01为差异极显著，具有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 活性提取物的确定

采用不同浓度（v/v）乙醇对马勃活性物进行提取，得到3种提取物，分别为马勃水提取物、45%乙醇提取物及95%乙醇提取物，得率见图1。

图1 马勃各提取物得率对比Fig.1 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extract

从图1中可以看出，随着乙醇浓度的升高，活性物得率也在增加。得率的增加可能是因为乙醇浓度越高破坏真菌细胞壁的能力越强，使可溶性物质溶出。

分别采用瓷板针挑法、试管法和复钙时间对3种马勃提取物进行体外凝血实验，结果见图2。

图2 马勃各提取物体外凝血实验结果（瓷板针挑法、试管法、复钙时间测定）Fig.2 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extract in vitro

从图2可以看出，马勃各提取物与空白对照组对比均有不同程度的差异，可以表明马勃提取物能有效的缩短血液凝聚时间，其中45%乙醇提取物体外凝血效果最佳，所以本实验选择45%乙醇提取物进一步分离，寻找止血活性部位。

2.2 活性部位的确定

通过体外凝血实验筛选马勃止血活性部位，由于45%乙醇提取物具有凝血活性，所以采用不同极性溶剂对其依次萃取，得率见图3。

图3 马勃各萃取部位得率对比Fig.3 Comparison of yield of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction

从图3中可以看出，随着萃取溶剂极性的增强，得率也在增加。

马勃不同萃取部位凝血实验结果表明，5种马勃萃取物和云南白药阳性对照组，与空白实验组相比均有不同程度的差异，说明马勃各萃取部位均能有效的缩短血液凝聚时间。

图4 马勃各萃取部位体外凝血实验结果（瓷板针挑法、试管法、复钙时间测定）Fig.4 Results of clotting experiment of Lasiosphaera Calvatia extraction fraction in vitro

从图4可以看出，马勃各萃取部位与空白对照组对比均有显著性差异（p＜0.05），其中正丁醇部位具有较好的止血效果。

3 结论

本文通过活性物追踪分离的方式，采用加热回流法对马勃活性物进行提取，通过体外凝血实验筛选出马勃止血活性提取物；对此提取物通过液液萃取的方式从低极性到高极性依次萃取，进一步通过体外凝血实验筛选出马勃止血活性部位（正丁醇部位），这为以后活性成分的捕捉提供理论基础。