测流层析技术标记材料的研究进展*

薛佳莹，崔向红，曹涤非，黄国庆，王 雷

（黑龙江省科学院高技术研究院，黑龙江 哈尔滨150020）

测流层析技术是基于毛细管作用力的移动速度差异，在反应基质上实现分离的色谱技术。测流层析技术由4个部分组成：样品垫、结合垫、层析膜和吸水垫（如下图所示）。样品垫为经过处理的纤维膜，用于快速吸收待测样品。结合垫多采用纤维膜或玻璃棉，负载有标记材料（如金标抗体），检测时标记材料与待检样品中的靶标物质结合形成可检测的复合物。层析膜主要使用硝酸纤维素膜，其上喷印检测线和质控线，用于显色标记的复合物，观察检测结果。吸水垫为吸水纸板，使样品在层析膜上侧向流动。测流层析技术（Lateral flow chromatographic assay）是检测食源性致病菌，肿瘤标志物，重金属，农药等简单快速灵敏的检测技术。其具有成本低，易操作，快速，稳定性好等优点[1]。

图1 测流层析试纸条结构示意图Fig.1 Schematic diagram of lateral flow chromatography strip

标记材料是影响测流层析技术灵敏度的关键因素之一。目前应用最广泛的是胶体金标记材料。这种标记材料不需要辅助仪器进行数据读取，但其灵敏度偏低。为了提高测流层析技术检测的稳定性与灵敏度，研究者们一直在不断探索寻找新的标记材料。本文就近年来出现的测流层析技术标记材料进行综述，并对其在农药残留检测方面的应用进行分析。

1 胶体金材料

胶体金（Collodical gold）是氯金酸中的金离子被还原成金颗粒，形成的胶体溶液。这种胶体溶液对蛋白质有较强的吸附能力，可与免疫球蛋白，多肽等非共价结合。在测流层析技术中胶体金颗粒在相应配体处大量聚集，形成肉眼可见的红色条带。是目前使用最多的标记材料[2]。胶体金非常稳定，粒径在20～40nm的胶体金最为适合做免疫层析实验。胶体金的标记受多种因素影响，如胶体金的酸碱度和配体蛋白的比例等。因此，需要对pH值、抗体加入量等因素进行优化实验，以得到最优条件的免疫金。目前，已成功开发出多种金纳米颗粒标记试纸用于检测杀虫剂等农药（见表1）。胶体金测流层析技术以其操作简单，方便快捷的优点，在农药残留检测中发挥了重要作用。

表1 胶体金试纸在农药残留检测领域中的应用Tab.1 Application of colloidal gold strip in the field of pesticide detection

2 胶体碳材料

胶体碳是碳黑经过表面处理所得胶体溶液。碳黑是一种表面积大的无定形碳。碳黑经过处理，引入羰基，羟基等亲水性的有机官能团，形成稳定性好的胶体碳。胶体碳有较好的灵敏度，其黑色信号与白色硝酸纤维素膜对比明显，并且较胶体金材料更加环保。魏艳秋等建立了胶体碳侧流免疫层析法检测埃博拉病毒[9]。研究者开发的胶体碳检测试纸最低检出限为100ng·mL-1，具有良好的特异性和稳定性，为快速检测提供了新的方法。曾艳等研制了以SB4型炭黑为标记材料的胶体碳检测试纸条，用于呋喃妥因代谢物的检测，其检测限为0.2μg·kg-1，可在15min内完成检测[10]。试纸操作方便，可用于大量样品的快速检测。

3 量子点材料

量子点（quantum dots,QDs）是由元素周期表中II～VI族或III～V族元素，两种或两种以上复合材料构成的纳米级别的半导体材料，粒径一般介于1～100nm之间[11]。量子点拥有窄发射光谱，宽激发范围，以及良好的稳定性。量子点标记可提高测流层析技术的灵敏度。由于量子点尺寸小，易团聚，在其做为标记材料与抗体连接之前需要先进行化学修饰[12]。量子点经过化学修饰后可以进行特异性链接，其细胞毒性低，可进行生物标记检测。Chen等研究者构建了基于量子点的电化学发光检测方法，用于检测有机磷农药的残留[13]。使用还原石墨烯氧化物-碲化镉量子点为阴极，羧基共轭聚合物为阳极。乙酰胆碱酯酶和胆碱酯酶发生酶促反应，消耗O2产生H2O2，此时阴极的石墨烯量子点信号因为溶解氧的消耗会减弱。阳极信号随着H2O2含量的增加而增强。当目标检测物质有机磷农药加入时，其特异性与乙酰胆碱酯酶结合，使酶活性下降。阳极信号会减弱，阴极信号会增强。这种电化学发光检测方法的检测限为0.125pM，线性检测范围为0.5pM～50nM。宋春霞等研制了一种基于CdTe量子点的荧光分析试纸用于检测水样中的Cu2+，可实现低至5μmol·L-1Cu2+的快速检测，为水体检测提供了一种新的快速方法[14]。与胶体金相比，量子点材料提高了检测的灵敏度。这是由量子点材料高信噪比的特点决定的。只是其数据读取需要外加紫外光源，结果判定复杂一些。

4 磁性材料

磁性材料经过化学修饰后，具有良好的水溶性和稳定性，目前己经广泛应用于生物检测和分离当中[15,16]。纳米级的磁性材料，可与抗体结合形成免疫磁珠。磁珠能对样品中分析物进行预浓缩和纯化，显著提高灵敏度。基于磁性纳米颗粒标记的测流层析技术己经广泛用于研究检测不同种类的蛋白质，如抗原[17]、肿瘤标记物[18]等。

Liu等研究者建立了磁性纳米材料标记的农药对氧磷残留检测试纸条。这种采用多聚赖氨酸和羰基交联制备出的磁性纳米材料的灵敏度较未交联的磁性材料Fe3O4母体高出40倍。最低检测线为1.7ng·mL-1[19]。洪立新等研究者将磁性纳米珠与单克隆抗体偶联，构建了针对心肌肌钙蛋白I（cTnI），肌酸激酶同工酶MB（CKMB）和肌红蛋白（Myo）3种心脏标志物的免疫层析试纸条[20]。测得定量下限cTnI为0.03ng·mL-1，CKMB为0.21ng·mL-1，Myo为0.17ng·mL-1。实现了对心梗三项的快速，特异性检测。

5 其它材料

为了提高测流层析试纸检测的精确度和灵敏度，研究者们不断的努力寻找新的特异性高，灵敏度好的标记材料。Cheng报道了一种使用Pt-Ni（OH）2纳米材料检测农药乙草胺，甲氰菊酯的二维测流层析检测方法[21]。研究者采用两步微波法制备Pt-Ni（OH）2纳米片层标记材料，再将其与抗体结合用于检测目标农药。所制得的试纸条对乙草胺和甲氰菊酯的检测限为0.63ng·mL-1和0.24ng·mL-1。研究者检测了玉米，苹果，卷心菜等实际样品，所得结果与气相色谱结果一致。研究者还开发了结合Android智能手机拍照功能的检测系统Strip Scan app，可进行快速定量分析。

华修德等研究者建立了一种上转换荧光纳米材料标记的农药氯噻啉层析检测方法[22]。将氨基功能化的上转换荧光纳米材料与氯噻啉单克隆抗体偶联制备层析试纸条，使用外接980nm激光光源的荧光分光光度计实现对氯噻啉的定量检测。在最优条件下，可在25min内完成检测，试纸条对氯噻啉的检出限为26.30ng·mL-1。上转换纳米材料是目前研究较多的一类稀土掺杂无机发光材料。Zou Rubing等研制了采用上转换纳米材料标记的3种有机磷农药检测试纸[23]。该试纸可在0.98～250ng·mL-1浓度范围内进行甲基对硫磷，对硫磷，杀螟硫磷的残留检测。上转换发光材料是反斯托克斯发光，其激发波长一般是近红外或红外光，发射出紫外或可见光。作为一种新型生物荧光标记物，其具有发射谱带窄、荧光背景低、无光漂白等优点。

6 结论和展望

测流层析技术在农药残留检测方面与气相色谱，液相色谱，质谱等方法相比，具有快速，便捷，操作简单的优点。标记材料在检测中起着连接抗体，显色的重要作用。其提供的检测信号决定了检测方法的特异性和灵敏度。传统的测流层析标记材料主要是胶体金，其主要通过非共价作用与抗体结合，检测灵敏度偏低，结果不能准确定量。为此，研究者们不断努力开发新的标记材料。量子点上转换纳米颗粒等新型材料在信号强度，稳定性方面较胶体金有很大提升。这些材料其表面需要修饰功能基团，然后通过共价键与抗体结合。在制备方法和使用条件方面需要进一步的研究，但其高灵敏度，高特异性的优点在未来测流层析检测试纸方向将有广阔的应用前景。