低胆固醇牛油的制备及其理化性质分析

刘琳，谢勇，刘越，郑万琴，肖德清，刘雄*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715)2(重庆帅克食品有限公司，重庆，402284)

食用牛油是由屠宰分割新鲜、洁净完好的脂肪组织精炼而成，精炼后的牛油为白色或浅黄色固体，质地均匀细腻，具有特殊的动物油脂风味[1]。牛油因富含维生素、脂肪酸、矿物质等营养物质并具有独特浓郁的脂肪风味，被广泛用于烘焙制品、香精香料、调味酱料包等各类食品加工制造领域[2]。

在川渝地区牛油主要用于制作火锅底料，以牛油火锅底料煮制的火锅，色泽光亮，味道浓郁，有着其他油脂无法比拟和替代的优点。由于火锅底料制作与食用的特殊性，在加工及涮煮过程中需要使用大量牛油。虽然牛油能赋予火锅独特的风味，但牛油中胆固醇含量较高，过多摄入会增加动脉粥样硬化、肥胖、冠心病和高血压等心血管疾病的发病风险[3-5]。与此同时，随着经济的发展，人民消费水平逐渐提高，消费者对于健康饮食的需求越来越高。因此，脱除牛油胆固醇就显得尤为重要。目前，国内外关于食品胆固醇脱除的主要方法有吸附剂吸附法、蒸馏法、超临界CO2法、复合电磁波法、溶剂抽提法、中草药精炼法、氧化酶分解法、β-环糊精包合法等[6]，其中，β-环糊精包合法脱除技术因成本低、安全、可食无毒、简单可行等优点受到重视，并在猪油、蛋黄、奶制品等方面得到广泛的应用[7-9]。因此，利用β-环糊精脱除牛油胆固醇具有一定的可靠性。但国内外鲜有关于油脂进行胆固醇处理后其基本性质的研究报道，尤其是食用牛油。任美燕等[10]采用中性Al2O3降低牛油中胆固醇含量且对牛油的基本理化性质影响小；朱巍[11]利用胆固醇氧化酶脱除液化猪油胆固醇后发现试样中脂肪酸组分基本不变；ALONSO等[12]使用β-环糊精降低牛乳中胆固醇含量，结果显示β-环糊精能有效脱除牛乳中胆固醇且不影响牛乳脂肪中的脂肪酸和甘油三酯成分。然而，国内外鲜有关于利用β-环糊精脱除牛油胆固醇后其性质变化的研究报道。因此，本实验首先以胆固醇脱除率为指标，采用β-环糊精包合法脱除牛油胆固醇，并探讨添加量、搅拌时间、搅拌温度对脱除效果的影响，其次，测定了所得低胆固醇牛油的脂肪酸、热力学特性、流变特性、风味物质等理化性质，为低胆固醇牛油产业化发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

纯牛油(肖老伍)，重庆市帅克食品有限公司；食品级β-环糊精，华兴生物化工有限责任公司；胆固醇标准品(纯度≥98%)，索莱宝公司；所有用于色谱的有机溶剂均为色谱纯；其余有机溶剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DSC 4000差示扫描热仪，美国PerkinElmer公司；UV-2450紫外分光光度计、QP 2030 PLUS 色谱-质谱联用仪(gas chromatofraphy-mass spectrmetry,GC-MS)，日本岛津公司；50/30 μm PDMS/CAR 萃取纤维头、SPME手动进样手柄，美国Supelco公司；DHR-1 TA流变仪，美国TA公司；JJ-1数显恒温调速电动搅拌器，方科仪器有限公司；离心机，安信实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 β-环糊精包合法脱除胆固醇

参照李相昕等[7]的方法并稍作调整。称取50 g牛油(已融化)于250 mL烧杯中，加入50 g去离子水和不同量的β-环糊精，混合均匀。将混合物置于不同温度的水浴锅中，以200 r/min速度搅拌不同时间后取出，在4 000 r/min下离心10 min，水洗3～4次，小心取出上层油脂，干燥后低温密封避光保存。

1.3.2 理化指标检测

胆固醇按GB/T 5009.128—2003比色法测定，酸价按GB/T 5009.229—2016冷溶剂指示剂滴定法测定，碘值按GB/T 5532—2008测定，过氧化值按GB/T 5009.227—2016的滴定法测定，熔点按GB/T 12766—2008测定，相对密度按GB/T 5518—2008测定，丙二醛按GB/T 5009.181—2016测定，水分及挥发物按GB/T 5009.236—2016电热干燥箱法测定。

1.3.3 胆固醇脱除率的计算

取各油样按照1.3.2的方法测定胆固醇含量，按公式(1)计算胆固醇脱除率：

(1)

式中:W1为牛油胆固醇含量，mg/g;W2为脱除胆固醇后牛油胆固醇含量，mg/g。

1.3.4 GS-MS脂肪酸含量的测定

样品前处理：参照ZHANG等[13]的方法并稍作修改。准确称取0.1 g油脂于试管中，加入5 mL正己烷，振荡5 min使其完全溶解；加入2 mL 0.5 mol/L的KOH-CH3OH溶液，充分摇匀后置于60 ℃水浴锅中加热30 min对样品进行甲酯化，静置分层1 h，取上清液进行分析，进样量为1 μL，每个样品平行测定3次，测定结果取平均值。

色谱条件[14]：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm);进样口温度250 ℃。程序升温：起始温度45 ℃; 20 ℃/min升温至140 ℃，保持2 min;10 ℃/min升温至180 ℃，保持2 min;2 ℃/min升温至210 ℃，保持5 min；2 ℃/min升温至230 ℃，保持8 min；10 ℃/min升温至250 ℃，保持2 min。载气He，流速1 mL/min，分流比50∶1。

质谱条件：离子源EI；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度 280 ℃；质量扫描范围(m/z)：5～500，标准质谱库NIST08 s.LIB。

数据处理：将样品质谱图数据与NIST08 s.LIB质谱数据库进行检索对比，再结合MS图中的特征碎片离子与相关参考文献即可对相应化合物定性，采用峰面积归一化法进行定量分析，测得各组分的相对百分含量。

1.3.5 热力学性质分析

参照LIU等[15]方法并稍作调整。精确称取样品7～8 mg放入DSC的专用铝盒中密封好，同时以密封的空白铝盒作为对照。具体温度变化程序为：常温下以5 ℃/min 快速升温至80 ℃，维持10 min以消除结晶热历史，然后以5 ℃/min 降温至-30 ℃，并维持10 min，使样品充分结晶，再以5 ℃/min升温至80 ℃，N2流量为20 mL/min，记录DSC熔化曲线与结晶曲线，并利用仪器自带软件进行计算处理。

1.3.6 流变学特性分析

参照王振杰等[16]方法并稍作修改。采用TA流变仪测定牛油的流变学特性。选择40.00 mm的平行板夹具，测试模式为Flow Ramp，测试间距为500 μm，剪切速率0.10～1 000.00 s-1，平衡时间为120 s；每次测量前需校正仪器；加样时必须保持样品的一致性与均匀性，避免挤压出现气泡；当转至修边高度时，小心移除多余的试样，从而避免边际效应干扰。在采集数据时，分别测定50、100 ℃操作台条件下的流变特性数据。

1.3.7 挥发性物质的测定

固相微萃取条件[17-18]：准确称取2.50 g样品置于20 mL顶空进样瓶中，用聚四氟乙烯隔垫密封，65 ℃下平衡10 min，通过隔垫将已老化(温度250 ℃、时间15 min)的75 μm PDMS/CAR固相微萃取头插入顶空瓶中距离液面1 cm处，吸附30 min，待GC-MS分析。

气相条件：DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度250 ℃。程序升温：起始温度40 ℃，保持3 min；5 ℃/min升温至60 ℃，保持1 min；2 ℃/min升温至100 ℃，保持1 min；4 ℃/min 升温至160 ℃，保持1 min；10 ℃/min升温至250 ℃，保持1 min。载气He，流速1.0 mL/min，不分流进样。

质谱条件：离子源EI；离子源温度230 ℃；电子能量70 eV；接口温度250 ℃；质量扫描范围(m/z)：50～550。

数据处理：结合NIST08 s.LIB质谱数据库进行检索对比定性，采用峰面积归一化法进行定量分析，测得挥发性物质各组分的相对百分含量。

关键风味物质确定[19]：采用相对气味活度值(relative odor activity value，ROAV)法分析各挥发性物质对牛油风味的贡献。定义对样品风味贡献最大的风味物质 ROAVstan=100，对其他风味物质相对气味活度值计算如公式(2)所示：

(2)

式中：CA，各挥发性风味物质的相对含量，%；TA，各挥发性风味物质的感觉阈值，μg/kg；Cmax，对总体风味贡献最大的挥发性风味物质的相对含量，%；Tmax，对总体风味贡献最大的挥发性风味物质的感觉阈值，μg/kg。ROAV≥1的组分为所分析样品的关键风味化合物，0.1≤ROAV<1的组分对样品的总体风味具有重要的修饰作用。

1.3.8 数据处理

采用SPSS 19.0统计软件和Excel软件进行方差分析和数据分析。

2 结果与分析

2.1 β-环糊精脱除牛油中胆固醇条件的优化

2.1.1 β-环糊精脱除牛油中胆固醇条件的优化

β-环糊精添加量、作用时间、作用温度对胆固醇脱除率的影响结果如图1所示，当搅拌温度为60 ℃，搅拌时间为1.5 h时，随着β-环糊精添加量的增大胆固醇脱除率先升高后降低，当添加量为3%(质量分数)时，胆固醇脱除率最高，当添加量超过3%时，胆固醇脱除率有缓慢下降的趋势。原因可能是β-环糊精可借助内腔疏水外围亲水的结构与非极性疏水化合物胆固醇形成包合物[7]，随着添加量增大，可包合胆固醇的分子增多，脱除率升高；但添加量过多，会导致体系黏度增加流动性减弱，增加β-环糊精与胆固醇分子间竞争，从而β-环糊精包合胆固醇分子的能力降低，胆固醇脱除率有所下降。当β-环糊精添加量为3%，搅拌温度为60 ℃时，胆固醇脱除率随着时间的延长先升高后降低，出现该现象可能是因为适当的搅拌时间会增加胆固醇与β-环糊精接触的机会，增大形成包合物的可能性，而长时间搅拌产生的剪切作用力会在一定程度上破坏已形成包合物的结构，释放出胆固醇分子[20]，从而脱除率下降，因此延长搅拌时间不利于提高胆固醇脱除率。在β-环糊精添加量为3%、搅拌时间为1.5 h时，随着温度的升高，脱除率先增加后下降，温度为45 ℃时，脱除率最高。这可能是温度过低导致牛油部分凝固，其体系黏度较大流动性差，减少了β-环糊精与胆固醇接触的机率，而温度升高流动性较好可增加接触机会形成包合物，但温度过高会影响包合物的稳定性，从而影响胆固醇脱除效果[21]。

图1 β-环糊精添加量、作用时间、作用温度对胆固醇脱除效果的影响Fig.1 Effect of β-cyclodextrin addition,adsorption time,adsorption temperature on the removal rate of cholesterol

2.1.2 β-环糊精脱除牛油中胆固醇最佳条件的选择

在单因素试验的基础上进行正交实验，对β-环糊精脱除牛油胆固醇工艺参数进行优化，结果见表1。由表1中的R值可知，影响牛油胆固醇脱除率因素的主次关系依次为C>A>B，即β-环糊精添加量对胆固醇脱除效果影响远大于作用时间与温度；最优组合A3B1C2在正交试验中未出现，不能确定此组合是否为最佳工艺，因此需要进行验证试验，在A3B1C2条件下进行平行实验，得到平均脱除率为(47.23±1.83)%，高于其他组的脱除率，说明β-环糊精添加量3%、搅拌时间1.5 h、搅拌温度45 ℃为相对最佳工艺。

2.2 胆固醇脱除前后牛油理化指标比较

牛油脱除胆固醇前后基本理化指标如表2所示，使用β-环糊精可明显降低牛油中胆固醇含量，处理后的牛油气味、组织状态、碘值、酸价、熔点与相对密度基本保持不变，水分含量增加可能与胆固醇脱除时加入水和水洗过程有关，过氧化值的增大可能是胆固醇脱除过程中加热油脂发生氧化所致。根据GB 10146—2015的规定，处理后牛油的基本理化指标与感官品质均符合国标规定，因此采用β-环糊精脱除胆固醇对牛油基本理化性质影响较小。

表1 β-环糊精脱除牛油中胆固醇工艺正交试验设计及结果Table 1 Orthogonal array design and results of β-cyclodextrin removal of cholesterol from beef tallow

2.3 GS-MS脂肪酸含量分析

牛油与低胆固醇牛油主要脂肪酸组成及相对含量变化见表3，由表3可知，牛油主要由油酸(C18∶1)、硬脂酸(C18∶0)、棕榈酸(C16∶0)3种脂肪酸组成，其中饱和脂肪酸含量较高占总量50%以上。脱除胆固醇后的牛油与未经处理牛油相比组分基本不变，这可能与β-环糊精特殊外围亲水内腔疏水的环状结构有关，该环状结构对非极性分子(如胆固醇)结合能力较强恰好可以使胆固醇进入，并能利用其疏水性质与胆固醇形成稳定的包合物并通过离心水洗方式除去而不影响主要脂肪酸组分变化[7]，这与ALONSO等利用β-环糊精脱除牛乳中胆固醇后脂肪酸与甘油三酯不变的研究相似[12]。而主要脂肪酸相对含量发生较小变化可能与脱除胆固醇过程中的处理温度和处理时间变化有关，王振杰等[16]在探究调和油时发现，油脂脂肪酸变化与处理时间、处理温度、热处理方式密切相关。一般在高温条件下，油脂因氧化、环化和异构化反应会生成小分子醛、酮、酸、环状物和异构体等物质[22]，但本实验处理温度较低，所以对油脂影响较小。

表2 牛油与低胆固醇牛油理化指标Table 2 Physical and chemical parameters of tallow and low cholesterol tallow

表3 牛油与低胆固醇牛油主要脂肪酸的组成及相对含量Table 3 Composition and relative content of main fatty acids in tallow and low cholesterol tallow

2.4 热力学性质分析

差示扫描量热法(different scanning calorimeter,DSC)是油脂研究中最常用的热分析技术，采用DSC能有效反映油脂在程序升温、降温及恒温条件下发生物理变化(结晶、熔化、晶型转变等)或化学变化时的吸热和放热现象，从而推测油脂的物理和化学特性[23]。

图2、图3分别为牛油与低胆固醇牛油的熔化与结晶曲线，它们相应的转变温度见表4。由图2～图3和表4可以看出，2个样品油脂熔化与结晶曲线峰形相似且出峰温度相近，CHIAVARO等[24]研究表明，不同油脂吸热峰和放热峰的不同，是由其脂肪酸的组成、链长、饱和度与不饱和度等不同而引起的，在脂肪酸含量测定中已表明2种油脂的脂肪酸种类与含量无明显变化，所以这2种油脂熔化与结晶曲线相似。在结晶过程中2个样品油脂均有2个吸热峰，出峰时间与峰形差别不大，均表现第1个高温放热峰面积小于最后一个低温放热峰面积，这是因为结晶过程中高熔点的组分先析出，相互聚集后形成晶体，随着温度不断降低，过冷度增大，大量低熔点组分迅速结晶，故出现较大放热峰，结晶峰变宽[25]。在熔化过程中2个样品油脂均有3个吸热峰，峰1、峰2熔融峰较窄，峰面积小，峰3熔融峰较宽，峰面积大。通常尖峰意味着构成晶体的甘油三酯组分比较单一，成核时间基本相同；而宽峰意味着晶体中有多种类型的晶核，峰形状的变化则对应着同质多晶的改变[1]。不同油脂特征性的脂肪酸与甘油三酯差异会显著影响其结晶和熔化特性，因此可以推测牛油进行胆固醇处理后不影响其甘油三酯组分与晶型变化。

图2 牛油及低胆固醇牛油DSC熔化图谱Fig.2 DSC melting profiles of tallow and low cholesterol tallow

图3 牛油及低胆固醇牛油DSC结晶图谱Fig.3 DSC crystallization profiles of tallow and low cholesterol tallow

表4 牛油、低胆固醇牛油结晶-熔化过程中DSC峰值温度比较Table 4 Comparison of DSC transition temperatures for melting and crystallisation curves of tallow and low cholesterol tallow

2.5 流变学特性分析

不同的油脂具有各自独有的特性，油脂的流变学性质可以用来表征其外观、结构、硬度、黏度等特性，这些特性为了解油脂内部结构、产品配方设计、质量控制及工艺设计提供了重要依据[26]。本研究主要通过测定2种油脂在50、100 ℃下剪切速率与黏度关系分析比较其流变学行为变化。

图4、图5为牛油与低胆固醇牛油在50、100 ℃条件下黏度随剪切速率变化的关系图。由图4、图5可知，在相同条件下，2种油脂表现出一致的流体行为，在剪切速率0～100 s-1表现出明显的剪切稀化的非牛顿流体的流变行为，随着剪切速率的增大，其流体黏度逐渐减小并趋于稳定，这主要是因为剪切速率的提高有利于油脂形成一种更加稳定且均匀的流体结构状态[27]；在剪切速率一定时，油脂在50 ℃时的黏度大于100 ℃的黏度，这是因为随着温度的增加，油脂内部分子的热运动加剧，从而增加了分子之间的流动性，导致分子之间的作用力减小，样品黏度降低[28]，王振杰等[16]研究温度对调和油黏度影响时也有相似结论。此外，2种油脂在相同条件下的黏度无显著性差异，可能是油脂黏度由脂肪酸的链长和不饱和度所决定[26]，在脂肪酸测定结果中已表明2种油脂主要脂肪酸差异较小；此外，还可以看出低胆固醇牛油黏度略小于牛油，这样有利于烫煮食材时减少油脂附着，从而减少油脂摄入量。

图4 牛油与低胆固醇牛油的黏度随剪切速率变化曲线(50 ℃)Fig.4 Shear rate-viscosity curve of tallow and low cholesterol tallow at 50 ℃

图5 牛油与低胆固醇牛油的黏度随剪切速率变化曲线(100 ℃)Fig.5 Shear rate-viscosity curve of tallow and low cholesterol tallow at 100 ℃

2.6 挥发性物质分析

采用顶空固相微萃取-气质联用技术萃取和分离鉴定牛油与低胆固醇牛油的挥发性风味物质成分，并通过风味物质ROAV值分析脱除牛油胆固醇后主要风味物质变化情况。

由表5可知,牛油与低胆固醇牛油的挥发性物质主要由烃类、醇类、醛类、酮类与酯类化合物构成，其中牛油与低胆固醇牛油分别测得87、84种挥发性物质，低胆固醇牛油中某些挥发性物质的消失与生成可能与β-环糊精的吸附作用和油脂水洗加热过程有关，但2种油脂挥发性物质种类相差不大，说明使用β-环糊精脱除牛油胆固醇不会对牛油的风味物质种类造成较大影响。牛油中烃类物质较多，其次是醛类、醇类和酯类化合物，而酸类和酮类较少。

烷烃类主要来源于脂肪酸烷氧自由基的断裂[35]，本实验检测出的烷烃类主要为萜烯烃、支链烷烃与一系列正构烷烃。虽然烃类物质阈值较高，气味较淡或者无气味，对整体风味贡献较小，但在风味研究中认为其具有不可忽视的基底作用[36]，如石竹烯等萜烯烃广泛存在于植物体内的，具有较强香气和生理活性[35]。来自样品中脂肪氧化分解的大部分醇类化合物具有令人愉快的香气，特别是不饱和醇类物质阈值较低，对风味贡献较大[37]，本实验检测出的反-2-甲基环已醇、异蒲勒醇和1-辛烯-3-醇均为不饱和醇，其中异蒲勒醇呈樟脑和薄荷香气，1-辛烯-3-醇呈蘑菇香，均对牛油风味形成产生一定作用。脂肪酸氧化降解产生的醛类物质是2种牛油样品中最重要的挥发性风味物质[37]，实验检测出的醛类物质从成分上看主要为直链饱和醛(如癸醛、十一醛等)和烯醛(如(E)-2-庚烯醛、(E,E)-2,4-庚二烯醛、(E)-2-辛烯醛等)，其中(E)-2-庚烯醛含量最高呈脂肪香味。一般认为酮类物质具有清香气味、奶油味或果香味，其主要来自醇的氧化产物或者酯类分解的产物[37]。含量最高的2-壬酮也为油脂提供水果、花、油脂和药草似香气。而可能由醇类和酸类化合物酯化生成的酯类物质可以使产品呈现果香与脂肪香[29]。如乙酸二氢戊酯呈花香、清香和豆香。

表5 牛油、低胆固醇牛油的中的挥发性物质种类及相对含量Table 5 Types and relative contents of volatile substances in tallow and low cholesterol tallow

续表5

由表6可知，(E,E)-2,4-庚二烯醛对2种油脂的贡献最大，定义(E,E)-2,4-庚二烯醛的ROAV为100，并计算其他挥发性风味化合物的ROAV，ROAV越大的组分对样品总体风味的贡献也越大，一般认为ROAV≥1的物质为所分析样品的关键风味成分，0.1≤ROAV≤1，该物质则对样品总体风味具有重要修饰作用，ROAV<0.1的组分为潜在风味物质[24]。由表5可知，醛类物质对牛油的整体风味贡献最大，其余类别风味物质贡献相对较小。2种牛油共有的关键风味物质有(E,E)-2,4-庚二烯醛、1-辛烯-3-醇、(E)-2-辛烯醛、癸醛、(E)-2-癸烯醛、(E,E)-2,4-壬二烯醛、(E,E)-2,4-癸二烯醛，其中(E,E)-2,4-庚二烯醛对两者风味贡献最大，芳樟醇、十二醛对总体风味具有重要的修饰作用，而正辛醛是牛油中独有的风味物质，十一烷、十二烷、十四烷因为相对含量低且感觉阈值高，对牛油的风味贡献很小。

总体上看，使用β-环糊精脱除牛油胆固醇，其挥发性风味化合物种类与相对含量变化较小，关键风味物质种类不变，且处理后的油脂保留了独特的风味。

表6 牛油与低胆固醇牛油挥发性风味物质ROAV值Table 6 ROAV of volatile substances of tallow and low cholesterol tallow

3 结论

本实验使用β-环糊精包合制备低胆固醇牛油，并对其基本理化性质进行测定分析，得到如下结论：

(1)最优工艺为β-环糊精添加量3%(质量分数)、搅拌时间1.5 h、搅拌温度45 ℃，此条件下牛油中胆固醇脱除率可达到(47±1.83)%，其中β-环糊精添加量对脱除效果影响最大。

(2)与未处理的牛油相比，低胆固醇牛油基本理化指标符合国标规定；主要脂肪酸种类与含量变化较小；熔化与结晶曲线峰形相似且出峰温度接近；在相同条件下黏度略低，更利于减少油脂附着从而降低油脂摄入量；挥发性风味化合物种类与相对含量变化较小，关键风味物质种类基本不变，处理后的牛油仍具有牛油的独特风味。

对脱除胆固醇后的牛油理化性质进行分析，可为健康牛油系列产品的开发提供理论基础。但本试验尚未进行放大试验，需要进一步深入研究。