粘虫高毒力白僵菌菌株筛选及其感菌后虫体内保护酶活性的变化

张 琛 陈思博 吴晨源 张步遥 张 瑛 滕 斌,* 胡本进

(1 安徽农业大学生命科学学院，安徽 合肥 230036；2 安徽省农业科学院水稻研究所，安徽 合肥 230031；3 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所，安徽 合肥 230031)

粘虫是一种严重威胁我国粮食生产安全的重大生物灾害，是我国玉米、小麦和水稻常见害虫之一，具有危害范围广、发生时间长、受害作物种类多等特点[1-2]。自上世纪90年代，我国局部地区粘虫危害一直持续，直至2012年发生了全国性粘虫灾害大爆发[3]。目前，利用毒死蜱、吡虫啉、溴氰菊酯等化学农药进行防治是最常用的粘虫治理方式，然而大量使用化学农药不仅会造成环境污染，增强害虫的抗药性，还会产生杀伤天敌等有益生物的负面效果[4-5]。球孢白僵菌(Beauveriabassiana)属于昆虫病原真菌，对环境友好，已被广泛应用于防治森林害虫和农业害虫[6]。目前在松毛虫(Dendrolimusspp.)、玉米螟(Ostriniapalustralis)和茶小绿叶蝉(Empoascaflavescens)等害虫防治方面均取得了成功[7]，并且研究工作已从表观病理学、流行病学层次，逐步深入到真菌与害虫互作的细胞和分子水平，表明球孢白僵菌作为安全环保的新型绿色生物农药，具有巨大的发展潜力和实际应用价值[8-9]。然而作为杀虫真菌，球孢白僵菌在生产实际应用中仍存在菌株防治效果不稳定，杀虫活性缓慢，以及自身抗逆性较差等缺点，因此在生产实践中选择高效菌株进行生物防治，是保证真菌农药大规模应用的关键因素之一。

昆虫的生命活动过程中，在遭遇如杀虫剂、微生物侵染、紫外线、重金属、热胁迫等自然界各种不良因素时，虫体会产生应激响应，体内保护性的抗氧化酶和解毒酶的活性会发生显著变化[10]。这些保护性的抗氧化酶主要包括应对活性氧损伤的过氧化物酶(peroxidase, POD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)以及参与昆虫免疫反应的酚氧化酶(phenoloxidase, PO)，解毒酶则主要包括分解有害物的羧酸酯酶(carboxylesterase, CarE)和谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione S-transferase, GSTs)[11-12]。与大多数昆虫病原真菌一样，球孢白僵菌菌丝入侵寄主后，也会引起寄主细胞产生一系列的生理应激反应，包括细胞代谢酶活性的变化。然而目前有关利用球孢白僵菌作为生防菌防治粘虫及其作用机制的研究鲜见报道。本研究拟通过评价不同球孢白僵菌菌株的生物学性状以及对粘虫的致死率，筛选高效生防菌株，并研究粘虫幼虫受球孢白僵菌感染后体内抗氧化酶和解毒酶的活力变化，以期揭示酶活力变化在粘虫防御反应中的作用，为合理利用球孢白僵菌防治粘虫提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

8株球孢白僵菌菌株和粘虫3龄幼虫由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所提供。

1.2 不同菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率及致死率测定

参照张龙娃等[13]的方法，在培养6 d的球孢白僵菌菌落边缘，采用直径为0.5 cm的打孔器，取菌丝块接种于萨氏培养基 (sabouraud medium， SDAY)，置于25℃培养箱中培养，重复处理3组，培养12 d，十字交叉法测量菌落生长直径，并计算菌落生长速率(mm·d-1)。 采用直径为0.5 cm的打孔器获取培养12 d的菌丝块，加入到含有0.05%吐温-80的无菌水中，充分振荡使孢子分散均匀，用血球计数板测定孢子数量。用无菌水收集白僵菌孢子，制成1×107个·mL-1孢子悬浮液，25℃振荡培养24 h后，显微观察孢子萌发数并统计萌发率。每菌株3次重复。

选择生物学性状表现良好的菌株，于25℃培养箱中培养，采集孢子粉，溶于含有0.05%吐温-80的灭菌蒸馏水中，制备浓度为1×108个·mL-1的孢子悬浮液。在供试粘虫3龄幼虫上方喷撒菌株孢子悬浮液，喷撒量为1 mL，对照组(CK)则用含0.05%的吐温-80无菌水处理。处理后立即将单头粘虫幼虫放入指形管中饲养，粘虫饲料配方：麦胚粉20.00 g、玉米叶粉20.00 g、白砂糖2.50 g、琼脂6.25 g、酵母粉6.25 g、Vc 1.00 g和水100 mL。每菌株处理12头幼虫，重复3次。上述试验连续观察10 d，统计各处理组的死亡幼虫数。以Abbott公式计算校正死亡率，校正死亡率=(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100%。

1.3 粘虫幼虫保护酶及解毒酶的测定

球孢白僵菌孢子悬浮液的制备及幼虫感染处理同1.2方法，共设24、36、48、60和72 h的感染时长处理。菌株感染处理后的3龄幼虫样品，分别加入0.05 mol·L-1pH值7.0的磷酸缓冲盐溶液 (phosphate buffer saline， PBS)，经研磨后，匀浆液于4℃ 10 000 r·min-1离心15 min，取上清液用于酶活测定。CAT、POD、PO和GSTs活性采用南京建成生物研制的试剂盒测定。CarE活性测定参照金剑雪等[14]的方法，反应液含0.5 mL酶液，分别加入0.2 mL 0.04 mol·L-1的PBS(pH值7.0)、0.83 mL 0.03 mmol·L-1的α-乙酸萘酯(含0.000 1 mol·L-1毒扁豆碱液0.03 mL)，在37℃水浴中震荡30 min，加入0.5 mL显色剂。室温下放置30 min于600 nm波长处测定OD值。重复3次，根据α-萘酚标准曲线方程求出酶促生成的萘酚量。

1.4 数据分析

采用SPSS 18.0统计软件对试验数据进行方差分析，采用Origin 17.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 不同菌株的生长速率、产孢量及孢子萌发率

由表1可知，菌株Bb345、Bb314、Bb378、Bb371生长速率较快，优于其他菌株，其中菌株Bb345的生长速率最大，达到2.70 mm·d-1，菌株Bb378、Bb371和Bb314的生长速率分别为2.58、 2.56和2.53 mm·d-1。 产孢量最多的菌株是Bb378，孢子量为20.44×107个·mL-1，菌株Bb314的产孢量次之，达18.32×107个·mL-1。菌株Bb314、Bb345、Bb378和Bb371的孢子萌发率高于其他菌株，其中菌株Bb314的萌发率最高，达96.12%。

2.2 不同菌株对粘虫幼虫的致死率

根据生长速率、产孢量、萌发率数据结果，选用菌株Bb314、Bb378、Bb371和Bb345进行感染幼虫致死率试验。从校正死亡率结果可知，菌株Bb314对粘虫幼虫表现出最强的致病力，致死率高达69.18%(图1)。因此，选用菌株Bb314做进一步侵染粘虫幼虫试验，研究该菌株侵染对虫体内保护性酶和解毒酶活性的影响。

表1 供试球孢白僵菌菌株的生长速率、产孢量及孢子萌发率Table 1 Growth rates, sporulation quantity, and spore germination rates of tested B. bassiana strains

注：不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Note:Different lowercase letters represent significant differene at 0.05 level.图1 不同球孢白僵菌菌株对粘虫3龄幼虫的致死率Fig.1 Lethality rates of the 3rdlarvae of armyworm infected with different strains of B. bassiana

注：不同大写字母表示同一时间下，对照与处理组间酶活性差异显著(P<0.01)。不同小写字母表示不同时间处理间酶活性差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different capital letters indicates significant difference between the control and treatment group at the same time (P<0.01). Different lowercase letters indicates significant differences between different treatments of infection time (P<0.05). The same as following.图2 球孢白僵菌Bb314对粘虫幼虫CAT(A)，POD(B)和PO (C)活性的影响Fig.2 Changes in enzyme activities of CAT(A), POD(B) and PO(C) in armyworm larvae infected with the B. bassiana strain Bb314

2.3 球孢白僵菌Bb314侵染对粘虫体内抗氧化酶活性的影响

菌株Bb314侵染粘虫后，虫体内CAT活性的变化如图2-A所示。结果表明，处理组CAT活性在侵染24 h时低于CK，在侵染36～48 h时迅速升高，CAT活性峰值出现在侵染48 h，为同时间点CK的1.3倍，然后缓慢下降，至72 h低于CK。由图2-B可知，3龄幼虫受菌株Bb314侵染24 h后，虫体内POD活性开始迅速上升，于36 h达到最大值，为CK的1.63倍，之后POD活性仍保持较高直至60 h；CK的POD活性变化不明显。CAT和POD是生物体内防止活性氧损伤的重要保护酶，在白僵菌侵染虫体后，POD率先响应，迅速升高，而CAT随后发生作用。本研究中CAT和POD的活性在侵染后期(72 h)下降，可能是由于白僵菌菌丝大量繁殖产生了较多真菌毒素，引起粘虫幼虫生理功能失衡，导致CAT和POD的合成及活性受到影响。

PO是昆虫参与免疫反应和伤口愈合反应的关键酶。由图2-C可知，菌株Bb314侵染幼虫后，虫体内PO活性迅速提高，呈现先上升后下降的趋势。侵染后24 h，处理组幼虫体内PO活性与CK活无显著差异；侵染36 h时，虫体内PO活性最高，且显著高于CK；侵染72 h后，处理组PO活性，显著低于CK。以上结果表明，病原菌的入侵，会激活PO产生黑化反应并消灭入侵的病原菌，但随着侵染时间的延长，白僵菌在幼虫血腔中的大量繁殖，造成细胞代谢失衡，导致PO活性下降。

2.4 球孢白僵菌Bb314侵染对幼虫体内解毒酶活性的影响

菌株Bb314侵染粘虫后，虫体内解毒酶活性的变化如图3-A所示。结果表明，菌株Bb314侵染24 h后CarE活性变化不明显，而随着侵染时间的延长，CarE活性逐渐升高，于侵染48 h达到峰值，之后开始降低；其中侵染36～60 h时，侵染处理的幼虫体内CarE活性显著高于CK。由图3-B可知，菌株Bb314侵染24～36 h期间，幼虫体内GSTs活性迅速提升，于侵染36 h达到最大值，且显著高于CK；侵染48 h后，处理组幼虫体内的GSTs活性较CK开始下降，且在侵染72 h时显著低于CK。

图3 球孢白僵菌Bb314对粘虫幼虫羧酸酯酶(A)和谷胱甘肽-5-转移酶(B)活性的影响Fig.3 Changes in enzyme activities of CarE (A) and GSTs(B) in armyworm larvae infected with the Beauveria bassiana strain Bb314

3 讨论

球孢白僵菌侵染多达700种以上的昆虫和螨类，是使用范围最广泛的一种昆虫病原真菌[15]。球孢白僵菌虽已在国内外被广泛应用于防治农林害虫[16]，然而其在粘虫的生物防治方面还鲜见相关报道。昆虫与昆虫病原真菌互作的研究，主要集中在高致病性菌株筛选、真菌发酵生产工艺改进、真菌毒素直接利用和虫生真菌分子致病机制等方面[17]，其中高致病力菌株筛选是防治害虫的基础。研究表明，菌落生长速率、菌株产孢量和孢子萌发率等生物学性状可以作为评价菌株致病力的重要指标[13-14,18]。孟祥坤等[19]发现球孢白僵菌对甜菜夜蛾3龄幼虫具有较高毒力，其产孢量高，生长最快。代晓彦等[20]通过研究球孢白僵菌的生长速率、产孢量以及对柑橘木虱若虫的侵染致死率，发现不同菌株在产孢量方面存在较大差异，而不同菌株的生长速率及对木虱低龄若虫的致死率则差异不显著。周今一等[21]测试了不同地理来源的球孢白僵菌对甜菜夜蛾幼虫的致死效应，发现同一昆虫病原真菌不同菌株的毒力存在明显差异。上述研究说明，菌株的菌落生长速度、产孢量等在菌株筛选时不能作为唯一的评价指标，并且不同地理来源的菌株对目标害虫的致病性也存在一定差异。因此，要筛选到高致病力的球孢白僵菌，需要以具体的昆虫为研究对象，根据菌株的生长速率、产孢量、孢子萌发率及致死率等生物学性状指标对菌株优劣进行综合评判。本研究以8株白僵菌菌株为研究材料，首先比较了这些菌株在生长速率、产孢量和孢子萌发率等指标方面的差异，结果显示，4株白僵菌为优势菌株；进一步通过测定粘虫幼虫致死率，对不同球孢白僵菌菌株的害虫致死率进行区分，最终筛选出的菌株Bb314具有显著的粘虫幼虫致死效果，校正致死率达到69.18%，且具有良好的生物学性状，其中孢子萌发率高达96.12%。

球孢白僵菌在侵染寄主时，其致病力和毒力与所在寄主体内的生理状态及其环境存在密切关系[22-23]。已有研究表明，白僵菌菌丝主要经表皮穿透体壁进入寄主血腔，与寄主免疫系统发生抗争。PO是昆虫体内体液免疫的关键因子，在昆虫免疫反应中发挥着关键性作用[12]。白僵菌入侵寄主后，寄主体内PO被激活可形成黑化反应，同时也造成寄主体内活性氧急剧升高[24]。通常，虫体在感染初期，体内抗氧化酶如POD、PO、CAT等会产生应激响应[25-26]，但随着菌丝的大量繁殖，虫体内抗氧化酶的合成和活性会受到抑制，表现出体内保护酶活性迅速下降，寄主体内氧化还原平衡状态被打破，最终引起寄主的一系列生理病理变化，导致寄主感病死亡[27-29]。

昆虫体内CarE和GSTs是2种重要的解毒酶，在细胞内许多重要代谢过程中起着重要作用[30-31]。GSTs广泛存在于动植物中[32]，是细胞内具有多种生物学功能的活性蛋白质，可以将谷胱甘肽和细胞内各种有害物结合，并转移出体外，从而降低细胞毒性，在消除机体过氧化物的累积方面发挥着独特的作用[33]。CarE是专一性催化酯键水解酶，不仅参与正常脂类代谢，而且可作为解毒酶，对外源毒素进行降解代谢[34-35]。本研究发现，球孢白僵菌Bb314侵染3龄粘虫幼虫后，虫体内PO、POD和CAT活性均呈先升高再下降的变化趋势，GSTs和CarE也呈现出近似的变化规律(图2、3)。其中，PO、POD和GSTs是率先发生作用的酶系,CAT和CarE是随后发生作用的酶系，表明粘虫体内不同类型保护性酶对白僵菌浸染的免疫响应存在时效差异。综合本研究结果认为，球孢白僵菌Bb314感染幼虫初期，幼虫可通过增强保护性酶和解毒酶的活性来维持虫体的正常生理功能。然而，随着侵染时间的延长，球孢白僵菌在幼虫体内大量增殖，幼虫自身的防卫能力迅速瓦解，表现为细胞内抗氧化酶和解毒酶等活性下降，机体内活性氧自由基和有毒代谢物不能及时清除，机能受到严重破坏，引起幼虫体内代谢紊乱，无法进行正常的生理生化活动，最终导致粘虫幼虫发病、死亡。

4 结论

本试验通过研究球孢白僵菌菌株在产孢量、萌发率及生长速率上的差异，并结合致死率，筛选获得了生物学性状良好且对粘虫具有高毒力的球孢白僵菌菌株Bb314。球孢白僵菌侵染粘虫幼虫后，侵染初期由于应激响应虫体内抗氧化酶CAT、GSTs和PO和解毒酶GSTs和CarE活性有所上升；后期虫体内CAT、GSTs和PO活性下降，其中GSTs和PO活性显著低于CK，同时POD和CarE活性也表现为先升高后下降的趋势，说明菌株Bb314可能通过影响幼虫体内抗氧化酶和解毒酶活性的动态平衡，进而对粘虫幼虫生理代谢造成影响。供试菌株中，菌株Bb314对粘虫的毒力最高，其具有作为粘虫生防菌的应用潜力。