草酸处理对桂七芒果冷害及细胞壁代谢的影响

李佩艳 尹 飞 党东阳 甘瑞卿 李鑫玲 梁 华

(1河南科技大学食品与生物工程学院/河南省食品原料工程技术研究中心，河南 洛阳 471023；2河南科技大学农学院，河南 洛阳 471023)

芒果(MangiferaindicaL.)是典型的冷敏型果实，贮藏温度低于13℃就会出现冷害现象[1]，主要表现为出现凹陷斑、果皮和果肉褐变、果肉硬度较高、不能正常后熟等[2-3]。冷害的发生会大大降低芒果食用价值和商品价值，造成严重的经济损失，因此研究控制芒果冷害技术及其冷害机理已成为芒果低温贮藏中亟待解决的关键问题。

诸多研究表明草酸不仅可用于采后果实贮藏保鲜以延缓果实成熟衰老过程[4-5]，而且还能提高采后果实抗冷性，减轻冷害的发生[6-8]。果胶、纤维素、半纤维素等细胞壁物质含量决定了采后果实的质地，这些细胞壁物质在果胶甲酯酶(pectin methyl enzyme，PME)、β-半乳糖苷酶(β-galactose glucoside enzyme，β-Gal)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase，PG)、纤维素酶(cellulase，Cx)等细胞壁代谢酶作用下会使细胞壁物质发生降解，引起细胞壁结构破坏，导致果实软化[9]。已有研究表明，通过调控细胞壁代谢能提高采后果实抗冷性，减轻冷害程度[10]。芒果受冷害严重时，硬度会增加，后不能正常后熟和软化，表明芒果冷害的发生与其细胞壁代谢有关。

先前研究表明草酸处理能降低采后芒果果实冷害的发生[1,11]，然而，低温胁迫下草酸处理对采后芒果细胞壁代谢方面的研究尚不清楚，尤其是草酸处理后芒果冷害与细胞壁代谢之间的关系更鲜见报道。因此，本试验以桂七芒果为试材，探究草酸处理对桂七芒果低温贮藏期间冷害、细胞壁组分、细胞壁水解酶活性的影响，旨在进一步揭示草酸减轻芒果冷害的机制，同时为草酸在桂七芒果果实低温贮藏保鲜中的应用提供理论基础，为其他冷敏型果蔬的低温贮藏保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桂七芒果果实于2018年7月上旬采摘于广西省百色市，约八成熟，空运至实验室。

1.2 主要仪器与试剂

MIR-553恒温恒湿箱，日本SANYO公司；FHM-5硬度计，日本竹村电机制作所；UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津公司；3-30K高速冷冻离心机，德国SIGMA公司；DDSJ-308A电导率仪，上海精密科学仪器有限公司。

草酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、咔唑、半乳糖醛酸、蒽酮、葡萄糖、多聚半乳糖醛酸、Tris-HCl、氯化钠(Nall)、乙二胺四乙酸、交联聚乙烯吡咯烷酮、果胶、溴麝香草酚蓝、巯基乙醇、乙酸、乙酸钠、对硝基-β-D-半乳糖苷、碳酸钠、羧甲基纤维素钠、3，5-二硝基水杨酸、乙醇等均为分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 试验设计 选择果形端正、大小均匀、无病虫斑和机械损伤的果实，用5 mmol L-1草酸溶液浸泡10 min，以浸清水为对照。果实于阴凉处(25℃)风干4 h，按每筐20个装入塑料筐，筐外套厚度0.05 mm聚乙烯薄膜袋，袋不封口，置于4℃低温贮藏28 d，常温后熟4 d。贮藏期间分别于0、7、14、21、28、28+4 d，测定相关生理生化指标，试验重复3次。其中，28+4 d为后熟阶段。

1.3.2 冷害指数 参照Li等[11]的方法。芒果冷害指数统计按果实表面的凹陷及冷害斑的面积分为5级：0级，芒果果实表面未出现凹陷及冷害斑；1级，芒果果实表面发病面积小于果实总面积的10%；2级，芒果果实表面发病总面积为果实总表面积的10%～20%；3级，芒果果实表面发病面积为果实总表面积的20%～30%；4级，芒果果实表面发病面积大于果实总表面积的30%。每组选择30个芒果果实。按照公式计算冷害指数：

冷害指数=Σ(病级果数×该级代表数值)/(调查总果数×最高级代表数值)×100%。

1.3.3 丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量测定 参考曹建康等[12]的硫代巴比妥酸法进行测定。

1.3.4 相对电导率测定 参照Li等[1]的方法。每处理分别取5个芒果果实，均取赤道部位果肉，将其切成小圆片(直径10 mm，厚3 mm)，取10个果实圆片放入小烧杯中加入30 mL水，测定煮沸前后溶液的电导率值，计算相对电导率。

1.3.5 硬度测定 参照Li等[11]的方法，每组选取10个芒果果实，选赤道处3个部位分别用硬度计进行测定，取平均值，试验重复3次。

1.3.6 原果胶和水溶性果胶含量测定 参考曹建康等[12]的咔唑比色法测定，原果胶和水溶性果胶含量均以生成的半乳糖醛酸占样品质量的百分数表示。

1.3.7 纤维素含量测定 采用酸碱醇醚法测定[12]，以样品经处理后残余物质量占原样品质量的百分数表示。

1.3.8 细胞壁水解酶测定 PG活性参考何俊瑜等[13]的方法测定。称取2 g芒果果肉加入6 mL Tris-HCl溶液(50 mmol·L-1，pH值7.0，内含2 mol·L-1NaCl，10 mmol·L-1乙二胺四乙酸，5 g·L-1交联聚乙烯吡咯烷酮)，冰浴研磨，12 000 r·min-1离心20 min，上清液即为酶液。以每小时每克鲜样37℃分解多聚半乳糖醛酸产生的游离半乳糖醛酸量表示，单位为mg·h-1·g-1FW。

PME活性参考徐晓波[14]的方法测定，略有改动。称取10 g芒果果肉加入10 mL NaCl研磨匀浆，12 000 r·min-1离心20 min，上清液即为酶提取液，加入2 mL 0.5%果胶、0.15 mL 0.01%溴麝香草酚蓝溶液、0.1 mL酶液混合，测定620 nm波长处的吸光度值，计算PME活性，单位为△620 nm·g-1·min-1。

β-Gal活性参考叶玲[15]的方法测定。称取2 g芒果果肉加入8 mL含有NaCl、巯基乙醇和聚乙烯吡咯烷酮的乙酸-乙酸钠缓冲液(50 mmol·L-1，pH值5.5)研磨成匀浆，12 000 r·min-1离心20 min，上清液即为酶提取液。试管中加入1 mL对硝基苯-β-D-半乳糖苷(3 mmol·L-1)，再加入0.1 mL酶提取液，37℃条件下水浴30 min，立即加入2 mL碳酸钠溶液(1 mol·L-1)终止反应，在400 nm波长处测定吸光度值。以每分钟每克鲜样37℃分解对硝基苯-β-D-半乳糖苷产生的对硝基酚量计算酶活性，单位为μmol·h-1·g-1FW。

Cx活性参考曹建康等[12]的方法测定。称取10 g芒果果肉，加入20 mL预冷的95%乙醇，冰浴研磨，4℃ 12 000 r·min-1离心20 min，弃上清，沉淀加入5 mL预冷的乙酸-乙酸钠缓冲液提取20 min，再次离心，上清液即为酶提取液。取0.5 mL酶液加入1.5 mL 10 g·L-1羧甲基纤维素钠，37℃水浴60 min，加入1.5 mL 3，5-二硝基水杨酸试剂，沸水浴5 min终止反应，测定540 nm波长处的吸光度值，单位为mg·h-1·g-1FW。

1.4 数据分析

所有测定均重复3次，结果表示为平均值±标准偏差。采用SPSS 17.0软件进行Duncan多重比较和Pearson相关性分析。

2 结果与分析

2.1 草酸处理对桂七芒果果实冷害指数的影响

由图1可知，桂七芒果冷害指数均随着贮藏时间的延长逐渐增加，对照组果实在贮藏14 d时出现冷害症状，而草酸处理组果实则在贮藏21 d时出现冷害症状。整个贮藏期间草酸处理组芒果冷害指数均显著低于对照组，后熟结束时，草酸处理组芒果冷害指数比对照组降低了22.50个百分点。由此可见，草酸处理能够提高低温胁迫下桂七芒果的抗冷性，减轻其贮藏期间冷害的发生。

注：不同小写字母表示同一贮藏时间两组间差异显著(P<0.05)。下同。Note: Different louercase letters indicate significant difference between different treatments at the same storage time at 0.05 level.图1 草酸处理对桂七芒果果实贮藏期间冷害指数的影响Fig.1 Effects of oxalic acid treatments on chilling injury index in Guiqi mango fruit during storage

2.2 草酸处理对桂七芒果果实MDA含量和相对电导率的影响

由图2-A、B可知，桂七芒果果实MDA含量和相对电导率均随着贮藏时间的延长逐渐上升。对照组果实MDA含量和相对电导率在整个贮藏过程中均高于草酸处理组，且在贮藏14～28+4 d期间，两处理具有显著差异。

2.3 草酸处理对桂七芒果果实硬度的影响

由图3可知，贮藏前14 d，对照组和草酸处理组之间的芒果实硬度变化不大；贮藏21 d后，随着贮藏时间的延长，对照组和草酸处理组果实硬度均急剧下降，贮藏末期及后熟期(28～28+4 d)对照组果实硬度显著高于草酸处理组。经贮藏后熟后，草酸处理组芒果果实硬度较对照组低21.03%。

图2 草酸处理对桂七芒果果实贮藏期间MDA含量(A)和相对电导率(B)的影响Fig.2 Effects of oxalic acid treatments on MDA content(A) and relative conductivity(B) in Guiqi mango fruit during storage

2.4 草酸处理对桂七芒果果实细胞壁组分含量的影响

原果胶是芒果果实细胞壁的主要成分之一，能保持果实组织坚硬，但随着果实成熟和衰老，原果胶会逐渐发生水解，细胞壁结构破坏，导致果实组织变得松弛、软化，硬度下降。由图4-A可知，贮藏前21 d，两组芒果果实原果胶含量变化不大，随着贮藏时间延长，两组果实中原果胶含量均呈急剧下降。但是，在整个贮藏过程中，草酸处理组果实中原果胶含量始终低于对照组，说明草酸处理可以维持低温胁迫下桂七芒果原果胶的正常降解，而对照组果实原果胶的降解受到了一定阻碍。

对照组和草酸处理组芒果水溶性果胶含量均呈逐渐上升趋势(图4-B)，这可能是由桂七芒果中原果胶转变为水溶性果胶引起的。草酸处理组贮藏前21 d芒果水溶性果胶上升缓慢，贮藏21 d后急剧上升；对照组芒果水溶性果胶贮藏前21 d期间变化不大，贮藏21 d后急剧上升。在整个贮藏和后熟期间，草酸处理组果实中水溶性果胶含量显著高于对照组。后熟结束后，草酸处理组芒果水溶性果胶较对照组提高了17.08%，且芒果水溶性果胶增加的趋势与原果胶降低的趋势基本一致，说明草酸处理能维持桂七芒果原果胶的水解程度，水溶性果胶含量不断增加。

图3 草酸处理对桂七芒果果实贮藏期间硬度的影响Fig.3 Effects of oxalic acid treatments on firmness in Guiqi mango fruit during storage

由图4-C可知，无论是草酸处理组还是对照组，桂七芒果果实中纤维素含量均随着贮藏时间的延长呈逐渐下降的趋势。草酸处理组纤维素含量在贮藏0～14 d期间急剧降低，之后缓慢下降，而对照组果实纤维素含量在贮藏0～21 d期间迅速下降，之后呈缓慢降低趋势，在整个贮藏期间草酸处理组芒果中纤维素含量均显著低于对照组。贮藏第28+4天时，草酸处理组桂七芒果中纤维素含量较对照组降低了1.47个百分点。

图4 草酸处理对桂七芒果果实贮藏期间原果胶、水溶性果胶和纤维素含量的影响Fig.4 Effects of oxalic acid treatments on content of original pectin, water soluble pectin and cellulose in Guiqi mango fruit during storage

2.5 草酸处理对桂七芒果果实细胞壁代谢关键酶的影响

PG能够切断果胶分子中α-1,4-糖苷键而将果胶分子降解为小分子物质。由图5-A可知，低温贮藏阶段桂七芒果果实PG活性较低，且随着贮藏时间的延长呈逐渐上升趋势；后熟阶段，PG活性急剧上升，并达到最大值，此时草酸处理组PG活性是对照组的1.50倍。同时，两组芒果果实PME活性也随着贮藏时间的延长均呈逐渐增加趋势(图5-B)，整个贮藏过程中，草酸处理组PME活性显著高于对照组。β-Gal通过去除果胶多聚醛酸侧链的半乳糖残基使果胶解聚或溶解。由图5-C可知，对照组和草酸处理组桂七芒果果实β-Gal活性在贮藏前14 d差异不大，随着贮藏时间延长两者差值逐渐增大，后熟结束时，草酸处理组β-Gal活性是对照组的1.39倍。纤维素酶通过降解纤维素和半纤维素中的木葡聚糖，使细胞壁果胶-纤维素-半纤维素结构破坏。由图5-D可知，贮藏过程中桂七芒果纤维素酶活性呈逐渐上升趋势，且草酸处理组纤维素酶活性始终高于对照组，后熟结束时，草酸处理组纤维素酶活性较对照组提高了45.89%。

图5 草酸处理对桂七芒果果实贮藏期间PG、PME、β-Gal和Cx活性的影响Fig.5 Effects of oxalic acid treatment on activities of PG, PME, β-Gal and Cx in Guiqi mango fruits during storage

3 讨论

桂七芒果的冷害症状主要表现为果皮出现凹陷、水渍状斑点，果皮变暗失去光泽，果实硬度较高、不能正常软化后熟。本试验结果表明，贮藏14 d后，低温胁迫下草酸处理组芒果冷害指数、MDA含量、相对电导率显著低于对照组，贮藏28 d后对照组果实硬度显著高于草酸处理组。说明草酸处理组果实冷害程度及症状较轻，果实能正常后熟软化，果实硬度较低，而对照组芒果果实受冷害程度严重，冷害症状明显，果实不能正常后熟软化，果实硬度较高。这也表明草酸处理减轻桂七芒果冷害与其维持桂七芒果果实细胞膜完整性，减少胞内物质渗出有关。

果实细胞壁主要由果胶、纤维素等物质构成，它们在PG、PME、Cx、β-Gal等作用下发生降解，导致细胞壁结构解体、果实软化[16-17]。魏建梅等[18]认为京白梨果实软化与细胞壁组分密切相关，β-Gal促进了果实早期软化，PME、PG促进了果实后期软化，而Gx作用不大。梁洁玉等[19]研究发现细胞壁酶活性变化对半边红李子果胶降解及果实软化影响较大，低温能够在一定程度上抑制细胞壁酶活性，降低果胶的代谢速率。陈克明等[20]认为引起水蜜桃果实冷害的重要原因是低温冷藏期间果胶类物质代谢异常。本试验结果表明，贮藏过程中，草酸处理组桂七芒果中原果胶和纤维素含量总体显著低于对照组，且草酸处理能显著促进原果胶在贮藏后期的降解，加速了纤维素在贮藏前期的降解，这表明原果胶和纤维素等含量降低是导致桂七芒果硬度下降的主要原因。

果实冷害的发生还与细胞壁代谢密切相关，这在黄瓜[10]、桃[21-23]、枇杷[24]和橄榄[25]等果蔬中已得到证实。低温胁迫会造成果实细胞壁纤维素和果胶质降解过程受阻[22-25]，冷害果实和正常果实中纤维素和果胶质降解过程受阻程度不同。果实细胞壁代谢酶PME、PG等活性不平衡会抑制果实正常的中胶层水解进程，导致果实出现木质化、细胞壁代谢异常，从而引起果实冷害的发生。采用热处理[26-28]、γ-氨基丁酸处理[22]等能调控低温贮藏果实细胞壁代谢酶活性，促进细胞壁物质水解，维持果胶物质正常降解，从而减轻采后果实冷害的发生。本研究表明，草酸处理降低了桂七芒果原果胶含量，提高了水溶性果胶含量，提高了PG、β-Gal、Cx、PME等细胞壁降解酶活性，说明草酸处理能提高果实细胞壁代谢关键酶，活性维持正常的细胞壁代谢。草酸处理降低桂七芒果冷害发生与其维持低温胁迫下果胶物质正常降解、提高可溶性果胶含量有关，这可能是草酸减轻桂七芒果冷害的原因之一。

4 结论

本研究结果表明，草酸处理能显著促进低温贮藏14 d后桂七芒果中原果胶和纤维素的降解，显著提高贮藏14 d后芒果果实中水溶性果胶、PG、PME、Cx活性，显著提高贮藏21 d后β-Gal活性、通过维持采后果实细胞壁降解酶较高活性和水溶性果胶含量，从而减轻冷害的发生。本研究结果不仅为进一步揭示草酸减轻芒果果实冷害机制提供了理论依据，而且对指导芒果果实低温贮藏保鲜具有一定的实际意义，同时也为草酸应用于其他冷敏型果实的贮藏保鲜提供了理论参考。