急性缺血性脑卒中患者血清微小RNA-20b、微小RNA-199a水平与神经功能缺损程度及侧支循环形成的关系▲

韦仕荣 高玉娟 韦晓阳 蒙 真 覃 俏 黄华生

(1 广西河池市人民医院神经内科,河池市 547000,电子邮箱：weishirong8233@163.com；2 广西柳州市中医医院脑病科,柳州市 545000)

脑卒中是由于动脉严重狭窄或闭塞导致脑组织缺血缺氧的一种临床常见脑血管疾病,分为缺血性和出血性两大类,其中缺血性脑卒中占60%～80%；脑卒中好发于40岁以上人群,且随着我国老龄人口增多,脑卒中发病率以每年8%的速度上升,且其病死率、致残率和复发率较高,严重危害患者生命健康[1-3]。目前对急性缺血性脑卒中(acute ischemic stroke,AIS)尚无统一有效的治疗方案,AIS治疗时间窗有限,能够通过有效的溶栓获救的患者不足3%,因此早期诊断并及时干预对改善患者预后具有重要意义[4]。血清标志物检测廉价、快捷,逐渐成为评估神经系统疾病发生发展的重要手段[5]。微小RNA(microRNA,miRNA)可参与基因表观遗传调控,在心血管疾病发生发展中起重要作用[6]。miRNA-20b可通过抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)生成来减少血管生成[7]。另有研究报道,miRNA-199a可抑制低氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)生成进而调控VEGF表达,在肿瘤血管生成中发挥重要作用,且miRNA-199a、HIF-1α、VEGF均对AIS病情严重程度及预后有不良影响[8-9]。但目前关于血清miRNA-20b、miRNA-199a在AIS中的作用鲜有报道。本研究探讨血清miRNA-20b、miRNA-199a水平与AIS患者神经功能缺损程度及侧支循环形成的关系,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2017年1月至2019年11月河池市人民医院收治的126例AIS患者为观察组,符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[10]关于急性缺血性脑血管病的诊断标准,患者首发症状主要有头晕头痛、偏瘫、身体单侧麻木及语言不清等。纳入标准：(1)患者均于发病后72 h内入院；(2)均经头部CT或MRI检查确诊；(3)患者均为首次发病,入院前未接受过溶栓治疗。排除标准：(1)入院时昏迷的患者；(2)既往有脑卒中病史或神经系统疾病者；(3)合并脑外伤者；(4)头颅恶性肿瘤或身体其他部位恶性肿瘤出现脑转移者；(5)患自身免疫性疾病、全身感染性疾病或血液性疾病者。其中男性70例,女性56例,年龄45～80(63.54±8.93)岁。根据脑侧支循环形成情况分为一级侧支循环组45例，二级侧支循环组41例，三级侧支循环组40例。其中，一级侧支循环组男性24例,女性21例,年龄45～79(61.47±8.62)岁；二级侧支循环组男性23例,女性18例,年龄45～80(62.85±8.73)岁；三级侧支循环组男性23例,女性17例,年龄45～80(63.94±8.41)岁。另选取同期在河池市人民医院行健康体检者126例为对照组。纳入标准：体检健康者。排除标准：严重肝肾疾病、自身免疫性疾病、酗酒(平均日饮酒量折合酒精≥125 g，且至少持续10年)者、冠心病或急性脑梗死者。其中男性73例,女性53例，年龄45～81(64.39±8.76)岁。观察组和对照组的年龄、性别比较,以及观察组中3个亚组AIS患者的年龄、性别比较,差异均无统计学意义(均P>0.05),具有可比性。本研究经河池市人民医院医学伦理委员会批准通过,所有研究对象均对本研究知情同意并签字确认。

1.2 方法

1.2.1 血清标本采集：采集所有研究对象清晨空腹外周静脉血5 mL,常温下3 000 r/min离心15 min,留取血清,置于-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 血清miRNA-20b、miRNA-199a相对表达水平检测：参照TRIzol试剂盒说明书提取血清总RNA,采用紫外分光光度计(美国贝克曼公司，型号：DU800，检测波长为260/280 nm)检测其浓度及纯度，OD比值(OD260/280)在1.8～2.1之间表示RNA质量合格。参照反转录试剂盒说明书，将获得的总RNA反转录为cDNA(反转录条件：16℃，30 min；42℃，30 min；85℃，10 min)，并置于-20℃保存备用。采用实时定量PCR(real-time quantitative PCR,qRT-PCR)检测血清miRNA-20b、miRNA-199a水平。TRIzol试剂、反转录试剂盒、qRT-PCR检测试剂盒均购自宝日医生物技术北京有限公司(批号：RR0944、RA3352、RK07132)。引物由碧云天生物技术研究所合成。qRT-PCR反应体系共20 μL，包括TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL,ROX Reference DyeⅡ(50×)0.4 μL,cDNA(50 ng/μL)2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL,双蒸水6 μL。qRT-PCR反应采用两步法,条件设置为：95℃,30 s；95℃,5 s；60℃,34 s,40个循环；添加溶解曲线。miRNA-20b上游引物序列为：5′-TGTCAACGATACGCTACGA-3′,下游引物序列为5′-GCTCTAGTGCAGGTAGAGC-3′；miRNA-199a上游引物序列为5′-TTCACTCCCATCAGTGTCAGCT-3′,下游引物序列为5′-CGTGCTTGTACTCCAGTCTCAA-3′；内参U6上游引物序列为5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAA-3′,下游引物序列为5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。采用2-ΔΔCt法定量分析血清miRNA-20b、miRNA-199a水平的相对表达水平。

1.2.3 血清HIF-1α、VEGF水平检测：采用酶联免疫吸附试验检测血清HIF-1α、VEGF水平,试剂盒分别购自碧云天生物技术研究所(批号：PH368)、美国Invitrogen公司(批号：BMS277-2)。具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.4 神经缺损程度评定方法：按照我国第四届脑血管病学术会议通过的《脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(1995)》[11]评估AIS患者入院时中国卒中量表(China Stroke Scale,CSS)评分,内容包括意识水平、凝视功能、言语、面肌、上肢肌力、手肌力、下肢肌力、步行能力等,总分最高45分,其中0分为正常，1～15分为神经功能轻度损伤,16～30分为神经功能中度损伤,31～45分为神经功能重度损伤。

1.2.5 侧支循环形成分级标准：入院后所有AIS患者均行头部MRI+磁共振血管造影检查。磁共振血管造影检查发现，Willis环交通支开放供血，颅外动脉系统通过颞浅动脉-眼动脉血管连接，颅内动脉系统通过软脑膜与脑膜中动脉血管连接，或不同脑室间软脑膜血管相互连接形成,即为侧支循环形成。根据其开放层次分为三级：一级侧支循环,主要由Willis环的血管构成；二级侧支循环,脑动脉、软脑膜及其他相对较小的侧支与侧支吻合支；三级侧支循环：通过血管生成的方式产生新生血管。侧支循环级数越高,提示侧支循环形成越良好。

1.3 统计学分析 使用 SPSS 20.0软件进行统计分析。正态分布计量资料以(x±s)表示,两组间比较用t或t′检验,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用SNK-q检验；偏态分布计量资料以[M(Q1,Q3)]表示,多组间比较采用Kruskal-WallisH检验。计数资料以例数和百分比表示,两两比较采用χ2检验。采用Pearson或Spearman法分析血清miRNA-20b、miRNA-199a水平与CSS评分、HIF-1α、VEGF水平的相关性。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组研究对象的血清miRNA-20b、miRNA-199a相对表达水平的比较 观察组血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均高于对照组(均P<0.05),见表1。

表1 两组血清miRNA-20b、miRNA-199a相对表达水平的比较(x±s)

2.2 3组AIS患者CSS评分、血清miRNA-20b、miRNA-199a、HIF-1α、VEGF水平的比较 随着侧支循环级数增加,AIS患者CSS评分、血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均降低,血清HIF-1α、VEGF水平均升高(均P<0.05)。见表2。

表2 3组AIS患者CSS评分、血清miRNA-20b、miRNA-199a、HIF-1α、VEGF水平的比较

2.3 3组AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平与CSS评分、HIF-1α、VEGF水平的相关性分析 AIS患者血清miRNA-20b水平与miRNA-199a水平呈正相关,且血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均分别与CSS评分呈正相关,与HIF-1α、VEGF水平呈负相关(均P<0.05)。见表3。

表3 AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平与CSS评分、HIF-1α、VEGF水平的相关性分析

3 讨 论

脑侧支循环是指当大脑供血动脉出现严重狭窄或闭塞时,血流可通过侧支血管到达脑缺血部位,从而使AIS患者脑组织得到不同程度灌注代偿。研究显示,卒中后患者神经功能缺损程度与侧支循环形成有关,良好的侧支循环可减少脑缺血发生率且预示预后良好[12]。

Little等[13]的研究结果显示,侧支循环良好的AIS患者神经功能缺损评分、最终梗死面积及溶栓后再灌注情况明显好于侧支循环不良者。本研究结果显示,随着侧支循环级数增加,AIS患者的CSS评分依次降低(P<0.05),提示侧支循环形成可能有利于减轻神经缺损程度。

VEGF是内皮细胞特异性有丝分裂原,具有促血管生成及促血管通透效应,研究显示,VEGF水平是冠状动脉侧支循环形成的影响因素[14]。局部组织缺血缺氧可诱导细胞低氧环境应答转录复合物HIF-1α表达增加,HIF-1α是VEGF上游基因产物,其可通过增加VEGF的表达,促进内皮细胞增生、迁移,增加内皮细胞通透性,促进血管生成,缓解缺血环境对机体造成的损伤[15]。近来有学者发现,miRNA可通过作用于HIF-1α、VEGF而在神经系统疾病发生发展中发挥重要作用[16]。其中miRNA-20a在冠心病患者血浆中呈低表达,其可通过调控VEGF表达参与冠状动脉侧支循环形成[17]。miRNA-20b属于miRNA-17-92基因簇产物,与miRNA-20a具有高度同源性,其在调控血管生成中发挥重要作用[18]。刘忆华等[19]的研究显示,miRNA-20b在肝癌组织中呈高表达,可通过调控HIF-1α、VEGF表达水平促进肿瘤血管生成以适应低氧环境,并促进肝癌细胞发生侵袭和转移。惠素艳[20]的研究显示,miRNA-199a定位于19号染色体,与缺血性脑卒中发生发展过程中的脑神经炎症反应有关, miRNA-199a-5p在缺血性脑卒中患者血清中呈高表达,且在缺血性脑卒中急性期、亚急性期和恢复期的表达水平呈下降趋势。苟凤钗等[21]的研究显示,miRNA-199a可通过靶向HIF-1α/VEGF通路,抑制缺氧环境下子宫内膜基质细胞的血管生成。本研究结果显示,观察组血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均高于对照组(均P<0.05),提示血清miRNA-20b、miRNA-199a水平升高可能与AIS的发生有关。本研究结果还显示,随着侧支循环级数增加,AIS患者的CSS评分、血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均依次降低,血清HIF-1α、VEGF水平均升高(P<0.05),且血清miRNA-20b水平与miRNA-199a水平呈正相关,血清miRNA-20b水平、miRNA-199a水平均分别与CSS评分呈正相关,与HIF-1α、VEGF水平呈负相关(均P<0.05),提示血清miRNA-20b、miRNA-199a水平与AIS患者神经功能缺损严重程度呈正相关,两者可能发挥协同作用,共同降低HIF-1α、VEGF的表达水平,从而减少侧支循环形成。

综上所述,AIS患者血清miRNA-20b、miRNA-199a水平均呈高表达,两者与AIS患者神经功能缺损程度呈正相关,并可能通过降低HIF-1α、VEGF表达水平来减少侧支循环形成。但由于本研究样本量少,且未能进一步分析AIS患者血清中的miRNA-20b、miRNA-199a与HIF-1α、VEGF是否存在直接靶向关系,今后仍需加大样本量、进一步深入探讨。