2株圣乔治教堂诺卡菌的鉴定与药物敏感性分析*

2020-11-30 03:17顾全柳朔怡韩素桂张尊孙尚凡张玉敏唐山市人民医院检验科核医学检验科输血科河北唐山06000唐山市妇幼保健院产前诊断遗传病诊断中心河北唐山06000唐山市中医医院检验科河北唐山06000
临床检验杂志 2020年10期
关键词:磺胺菌种教堂

顾全,柳朔怡,韩素桂,张尊,孙尚凡,张玉敏(1.唐山市人民医院 a.检验科,b.核医学检验科,c.输血科,河北唐山 06000;.唐山市妇幼保健院产前诊断遗传病诊断中心,河北唐山 06000;.唐山市中医医院检验科,河北唐山 06000)

诺卡菌属是一类严格需氧菌,革兰染色呈阳性或不定,有弱抗酸性。其分类隶属于放线菌纲、放线菌目、棒杆菌亚目、诺卡菌科,目前已知该属有效命名菌种有111个,常见致病菌种有脓肿诺卡菌(N.abscessus)、皮疽诺卡菌(N.farcinica)、巴西诺卡菌(N.brasiliensis)等。圣乔治教堂诺卡菌(N.Cyriacigeorgica)是2001年命名的诺卡菌种,但非新发致病菌[1]。在确定独立分类位置之前多被鉴定为“星形诺卡菌(N.asteroides)”药物Ⅵ型。2005年Conville等通过16S rRNA基因、hsp65基因和DNA-DNA杂交等分类证据证实星形诺卡菌药物Ⅵ型应鉴定为圣乔治教堂诺卡菌[2]。目前圣乔治教堂诺卡菌是日本、泰国和我国台湾地区诺卡菌病的主要致病菌种[3],并在近年来我国大陆地区报告比率逐渐上升,部分地区可达46%[4]。按《临床微生物手册》(第11版)报道,圣乔治教堂诺卡菌可能是常见的人类诺卡菌病原体,之前报道的星形诺卡菌大部分是该种[5]。随着分子鉴定技术的发展,过去鉴定为“星形诺卡菌”或“星形诺卡菌复合群”菌株多被证实为其他已命名菌种,严格意义的星形诺卡菌已少有致病报道[5]。本研究对2株诺卡菌临床分离株进行表型与基因鉴定,并对临床常用抗菌药物进行体外药敏试验,为临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源与初步鉴定 收集2019年唐山市人民医院临床分离诺卡菌菌株2株。其中A30分离自呼吸科患者支气管灌洗液标本,A151分离自妇科患者痰标本。经革兰染色和弱抗酸染色镜下观察形态,初步鉴定至诺卡菌属。

1.2主要仪器及试剂 SLAN基因扩增仪(上海宏石公司),ABI 3730型DNA测序仪(美国ABI公司);2×Taq PCR Mix扩增体系(上海生工公司),血琼脂培养基、巧克力平板、麦康凯平板(郑州安图公司),药敏纸片与E-test药敏试条(温州康泰公司),快速革兰染色液、快速抗酸染色液(珠海贝索公司),引物合成与扩增产物测序由上海生工公司完成。

1.3形态学鉴定 菌株分别接种血琼脂培养基、麦康凯培养基,置35 ℃培养48~72 h,观察菌落形态。革兰染色按试剂说明书进行操作;弱抗酸染色参考快速抗酸染色试剂说明书略作改动:石炭酸复红溶液染色15 min,0.2 mol/L硫酸溶液脱色3 min,亚甲基蓝溶液染色1 min。

1.4基因扩增、测序与鉴定 用水煮裂解法提取DNA[6]。参照文献[7-8]合成原核生物16S rRNA基因通用引物8F、1492R和hsp65基因引物,并参照文献反应条件进行。引物与扩增信息见表1。用2×Taq PCR Mix预混液配制体系。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察,交由上海生工公司进行产物纯化并在ABI 3730型DNA测序仪上行Sanger双向测序。测序结果截去引物结合区并选取QV值>25的片段,以Blast比对搜索GenBank数据库。以MEGA 5.0软件构建16S rRNA基因与hsp65基因系统进化树,用邻接法与Kimura两参数模型,进化树拓扑枝以Bootstrap法自举检验1 000次。龟分枝杆菌作为系统进化树外枝。

表1 基因扩增所用引物信息

1.5药敏分析 用E-test方法测定最低抑菌浓度(MIC)[9],测试药物包括阿米卡星、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、妥布霉素、头孢吡肟、庆大霉素。35 ℃培养48 h后读取MIC值,若生长不足,培养时间延至72 h。参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M24-A2标准判读结果[10]。用E-test法、微量肉汤稀释法和纸片扩散法对甲氧嘧啶/磺胺甲噁唑药敏结果进行验证,35 ℃培养48 h,若生长不足延至72 h。复方磺胺甲噁唑MIC值≤2 μg/mL/38 μg/mL为敏感,≥4 μg/mL/76 μg/mL为耐药。纸片扩散法中,抑菌圈直径≥35 mm判为敏感,≤15 mm判为耐药。微量肉汤稀释法中,菌体生长量80%被抑制判为终点孔。

2 结果

2.1菌株形态学鉴定 圣乔治教堂诺卡菌可在血平板、巧克力平板上缓慢生长,培养24 h后出现小的颗粒样菌落,培养72 h后呈淡黄色、干燥、堆积样菌落,有泥土气味,麦康凯平板未见生长。革兰染色阳性,菌体可部分脱色呈串珠状。有弱抗酸性,可抵抗0.2 mol/L硫酸溶液脱色,临床标本中菌体呈分枝状,可相互缠绕,见图1。

注:A,圣乔治教堂诺卡菌血平板培养72 h生长菌落;B,痰标本中圣乔治教堂诺卡菌弱抗酸染色形态(×1 000);C,圣乔治教堂诺卡菌血琼脂平板培养72 h革兰染色形态(×1 000)。

2.2基因鉴定与进化分析 A30和A151 16S rRNA基因与圣乔治教堂诺卡菌(N.cyriacigeorgica,登录号:NR041857.1)相似度分别为99.92%和100%,与少食诺卡菌(N.paucivorans,登录号:NR041863.1)相似度为98.83%和98.59%,与星形诺卡菌(N.asteroides,登录号:NR041856.1)相似度为98.46%和95.53%。2株临床分离株可鉴定为圣乔治教堂诺卡菌,测序生物信息学数据见表2。经2次双向测序,发现A30菌种在16S rRNA基因48位为简并碱基R(A/G),可能是该菌存在多拷贝的16S rRNA基因,见图2。A30和A151hsp65基因与圣乔治教堂诺卡菌(N.cyriacigeorgica,登录号:AY756522.1)相似度均为100%,与其他诺卡菌种相似度低于98.6%。16S rRNA基因与hsp65基因的系统进化树显示,A30与A151均与圣乔治教堂诺卡菌DDSM 44484在同一拓扑分枝,与其他诺卡菌种有较大进化距离。见图3、图4。

表2 2株诺卡菌测序生物信息学分析数据

图2 圣乔治教堂诺卡菌A30菌株16S rRNA基因多拷贝位点

注:以龟分枝杆菌(M. chelonae)AY457072.1为根。

注:以龟分枝杆菌(M. chelonae)JX154110.1为根。

2.3药敏试验结果 2株圣乔治教堂诺卡菌对阿米卡星、头孢曲松、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、妥布霉素、头孢吡肟、复方磺胺甲噁唑均敏感,对环丙沙星耐药。纸片扩散法显示,A30和A151菌株复方磺胺甲噁唑抑菌圈直径分为38 mm和19 mm。E-test法和微量肉汤稀释法确定复方磺胺甲噁唑MIC值分别为0.125 μg/mL/2.375 μg/mL和0.5 μg/mL/9.5 μg/mL。见表3。

表3 2株圣乔治教堂诺卡菌抗菌药物敏感性结果

3 讨论

圣乔治教堂诺卡菌的中文翻译尚有分歧,部分学者引用“盖尔森基兴诺卡菌”翻译。2019年国际系统与进化微生物学期刊《International Journal of Systematics of Evolutionary Microbiology》更新了《国际原核生物分类命名法》,原核生物命名有明确的词源,中文翻译可参考词源。“cyriacigeorgica”由2个词根组成:“cyriacum”新拉丁语中性名词,来源于希腊语中性名词“kuriakon”,意为教堂;“georgica”新拉丁语阴性名词,意为“圣乔治”,“cyriacigeorgica”词源意为圣乔治教堂[11]。诺卡菌镜下形态呈分枝状,弱抗酸性,属内鉴定较复杂,需结合碳源利用试验、硝酸盐还原试验、明胶液化、脲酶、药物敏感性等综合进行[12]。16S rRNA基因和hsp65基因是目前较为常用的诺卡菌种基因鉴定靶位。诺卡菌的16S rRNA相似度较高,部分诺卡菌菌种16S rRNA基因存在多拷贝[13],若需准确鉴定至种,相似度需大于99.8%。如本研究的A30菌株16S rRNA基因测序结果显示在48位出现简并碱基R(A/G),多拷贝基因会影响比对结果准确性。圣乔治教堂诺卡菌为新命名菌种,在GenBank数据库中的早期序列中,有将圣乔治教堂诺卡菌错误标记为星形诺卡菌,会影响鉴定结果。采用其他管家基因或构建系统进化树,可增加鉴定的可信度。如hsp65基因,相似度大于99.5%,可提供准确的鉴定依据[8]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)为诺卡菌快速鉴定提供了新的方法。通过提取蛋白质法或菌液直接涂布法,均能准确鉴定圣乔治教堂诺卡菌。但大部分诺卡菌种培养物不易乳化或存在噬琼脂现象,这会增加菌悬液制备难度而影响鉴定准确率,若选取早期培养菌落(菌龄小于48 h),可提升质谱鉴定率[5]。

诺卡菌感染的首选用药为复方磺胺甲噁唑,必要时可配伍亚胺培南。近年来不断出现诺卡菌耐药现象,特别是磺胺类药物的耐药。此外,CLSI推荐的微量肉汤稀释法在多中心重复性研究中,重复性较低[14],可能与该药物MIC终点值判断困难有关。通常终点值对应该孔80%菌量被抑制,但在实际操作中,由于诺卡菌浮于药敏孔表面不易判断抑菌量,或判读人员经验不足,极易出现误差。微量肉汤稀释法配合纸片扩散法与E-test法,药敏结果可相互验证,可避免误差[15]。本研究中A151菌株复方磺胺甲噁唑纸片扩散法抑菌圈直径为19 mm,无法判断敏感性,配合微量肉汤稀释法与E-test法,可以确定其MIC值为1 μg/mL/38 μg/mL,依据CLSI M24-A2的折点范围可判断为敏感。依据CLSI标准,复方磺胺甲噁唑的药敏试验使用的磺胺甲噁唑/甲氧苄啶复方配比为19∶1,而临床使用的复方磺胺甲噁唑磺胺甲噁唑/甲氧苄啶配比为5∶1。药敏试验复方配比与临床复方制剂配比不同,可能导致体外药敏结果无法有效预测感染治疗效果。磺胺类药物为浓度依赖型,需要足够的浓度与对氨苯甲酸竞争结合二氢叶酸合成酶,临床用药参考药敏标准时需要酌情考虑使用量。

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