2株圣乔治教堂诺卡菌的鉴定与药物敏感性分析*

顾全，柳朔怡，韩素桂，张尊，孙尚凡，张玉敏(1.唐山市人民医院 a.检验科，b.核医学检验科，c.输血科，河北唐山 06000；.唐山市妇幼保健院产前诊断遗传病诊断中心，河北唐山 06000；.唐山市中医医院检验科，河北唐山 06000)

诺卡菌属是一类严格需氧菌，革兰染色呈阳性或不定，有弱抗酸性。其分类隶属于放线菌纲、放线菌目、棒杆菌亚目、诺卡菌科，目前已知该属有效命名菌种有111个，常见致病菌种有脓肿诺卡菌(N.abscessus)、皮疽诺卡菌(N.farcinica)、巴西诺卡菌(N.brasiliensis)等。圣乔治教堂诺卡菌(N.Cyriacigeorgica)是2001年命名的诺卡菌种，但非新发致病菌[1]。在确定独立分类位置之前多被鉴定为“星形诺卡菌(N.asteroides)”药物Ⅵ型。2005年Conville等通过16S rRNA基因、hsp65基因和DNA-DNA杂交等分类证据证实星形诺卡菌药物Ⅵ型应鉴定为圣乔治教堂诺卡菌[2]。目前圣乔治教堂诺卡菌是日本、泰国和我国台湾地区诺卡菌病的主要致病菌种[3]，并在近年来我国大陆地区报告比率逐渐上升，部分地区可达46%[4]。按《临床微生物手册》(第11版)报道，圣乔治教堂诺卡菌可能是常见的人类诺卡菌病原体，之前报道的星形诺卡菌大部分是该种[5]。随着分子鉴定技术的发展，过去鉴定为“星形诺卡菌”或“星形诺卡菌复合群”菌株多被证实为其他已命名菌种，严格意义的星形诺卡菌已少有致病报道[5]。本研究对2株诺卡菌临床分离株进行表型与基因鉴定，并对临床常用抗菌药物进行体外药敏试验，为临床治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1菌株来源与初步鉴定 收集2019年唐山市人民医院临床分离诺卡菌菌株2株。其中A30分离自呼吸科患者支气管灌洗液标本，A151分离自妇科患者痰标本。经革兰染色和弱抗酸染色镜下观察形态，初步鉴定至诺卡菌属。

1.2主要仪器及试剂 SLAN基因扩增仪(上海宏石公司)，ABI 3730型DNA测序仪(美国ABI公司)；2×Taq PCR Mix扩增体系(上海生工公司)，血琼脂培养基、巧克力平板、麦康凯平板(郑州安图公司)，药敏纸片与E-test药敏试条(温州康泰公司)，快速革兰染色液、快速抗酸染色液(珠海贝索公司)，引物合成与扩增产物测序由上海生工公司完成。

1.3形态学鉴定 菌株分别接种血琼脂培养基、麦康凯培养基，置35 ℃培养48～72 h，观察菌落形态。革兰染色按试剂说明书进行操作；弱抗酸染色参考快速抗酸染色试剂说明书略作改动：石炭酸复红溶液染色15 min，0.2 mol/L硫酸溶液脱色3 min，亚甲基蓝溶液染色1 min。

1.4基因扩增、测序与鉴定 用水煮裂解法提取DNA[6]。参照文献[7-8]合成原核生物16S rRNA基因通用引物8F、1492R和hsp65基因引物，并参照文献反应条件进行。引物与扩增信息见表1。用2×Taq PCR Mix预混液配制体系。扩增产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳观察，交由上海生工公司进行产物纯化并在ABI 3730型DNA测序仪上行Sanger双向测序。测序结果截去引物结合区并选取QV值>25的片段，以Blast比对搜索GenBank数据库。以MEGA 5.0软件构建16S rRNA基因与hsp65基因系统进化树，用邻接法与Kimura两参数模型，进化树拓扑枝以Bootstrap法自举检验1 000次。龟分枝杆菌作为系统进化树外枝。

表1 基因扩增所用引物信息

1.5药敏分析 用E-test方法测定最低抑菌浓度(MIC)[9]，测试药物包括阿米卡星、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、妥布霉素、头孢吡肟、庆大霉素。35 ℃培养48 h后读取MIC值，若生长不足，培养时间延至72 h。参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)M24-A2标准判读结果[10]。用E-test法、微量肉汤稀释法和纸片扩散法对甲氧嘧啶/磺胺甲噁唑药敏结果进行验证，35 ℃培养48 h，若生长不足延至72 h。复方磺胺甲噁唑MIC值≤2 μg/mL/38 μg/mL为敏感，≥4 μg/mL/76 μg/mL为耐药。纸片扩散法中，抑菌圈直径≥35 mm判为敏感，≤15 mm判为耐药。微量肉汤稀释法中，菌体生长量80%被抑制判为终点孔。

2 结果

2.1菌株形态学鉴定 圣乔治教堂诺卡菌可在血平板、巧克力平板上缓慢生长，培养24 h后出现小的颗粒样菌落，培养72 h后呈淡黄色、干燥、堆积样菌落，有泥土气味，麦康凯平板未见生长。革兰染色阳性，菌体可部分脱色呈串珠状。有弱抗酸性，可抵抗0.2 mol/L硫酸溶液脱色，临床标本中菌体呈分枝状,可相互缠绕，见图1。

注：A，圣乔治教堂诺卡菌血平板培养72 h生长菌落；B，痰标本中圣乔治教堂诺卡菌弱抗酸染色形态(×1 000)；C，圣乔治教堂诺卡菌血琼脂平板培养72 h革兰染色形态(×1 000)。

2.2基因鉴定与进化分析 A30和A151 16S rRNA基因与圣乔治教堂诺卡菌(N.cyriacigeorgica，登录号：NR041857.1)相似度分别为99.92%和100%，与少食诺卡菌(N.paucivorans，登录号：NR041863.1)相似度为98.83%和98.59%，与星形诺卡菌(N.asteroides，登录号：NR041856.1)相似度为98.46%和95.53%。2株临床分离株可鉴定为圣乔治教堂诺卡菌，测序生物信息学数据见表2。经2次双向测序，发现A30菌种在16S rRNA基因48位为简并碱基R(A/G)，可能是该菌存在多拷贝的16S rRNA基因，见图2。A30和A151hsp65基因与圣乔治教堂诺卡菌(N.cyriacigeorgica，登录号：AY756522.1)相似度均为100%，与其他诺卡菌种相似度低于98.6%。16S rRNA基因与hsp65基因的系统进化树显示，A30与A151均与圣乔治教堂诺卡菌DDSM 44484在同一拓扑分枝，与其他诺卡菌种有较大进化距离。见图3、图4。

表2 2株诺卡菌测序生物信息学分析数据

图2 圣乔治教堂诺卡菌A30菌株16S rRNA基因多拷贝位点

注：以龟分枝杆菌(M. chelonae)AY457072.1为根。

注：以龟分枝杆菌(M. chelonae)JX154110.1为根。

2.3药敏试验结果 2株圣乔治教堂诺卡菌对阿米卡星、头孢曲松、亚胺培南、利奈唑胺、米诺环素、妥布霉素、头孢吡肟、复方磺胺甲噁唑均敏感，对环丙沙星耐药。纸片扩散法显示，A30和A151菌株复方磺胺甲噁唑抑菌圈直径分为38 mm和19 mm。E-test法和微量肉汤稀释法确定复方磺胺甲噁唑MIC值分别为0.125 μg/mL/2.375 μg/mL和0.5 μg/mL/9.5 μg/mL。见表3。

表3 2株圣乔治教堂诺卡菌抗菌药物敏感性结果

3 讨论

圣乔治教堂诺卡菌的中文翻译尚有分歧，部分学者引用“盖尔森基兴诺卡菌”翻译。2019年国际系统与进化微生物学期刊《International Journal of Systematics of Evolutionary Microbiology》更新了《国际原核生物分类命名法》，原核生物命名有明确的词源，中文翻译可参考词源。“cyriacigeorgica”由2个词根组成：“cyriacum”新拉丁语中性名词，来源于希腊语中性名词“kuriakon”，意为教堂；“georgica”新拉丁语阴性名词，意为“圣乔治”，“cyriacigeorgica”词源意为圣乔治教堂[11]。诺卡菌镜下形态呈分枝状，弱抗酸性，属内鉴定较复杂，需结合碳源利用试验、硝酸盐还原试验、明胶液化、脲酶、药物敏感性等综合进行[12]。16S rRNA基因和hsp65基因是目前较为常用的诺卡菌种基因鉴定靶位。诺卡菌的16S rRNA相似度较高，部分诺卡菌菌种16S rRNA基因存在多拷贝[13]，若需准确鉴定至种，相似度需大于99.8%。如本研究的A30菌株16S rRNA基因测序结果显示在48位出现简并碱基R(A/G)，多拷贝基因会影响比对结果准确性。圣乔治教堂诺卡菌为新命名菌种，在GenBank数据库中的早期序列中，有将圣乔治教堂诺卡菌错误标记为星形诺卡菌，会影响鉴定结果。采用其他管家基因或构建系统进化树，可增加鉴定的可信度。如hsp65基因，相似度大于99.5%，可提供准确的鉴定依据[8]。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)为诺卡菌快速鉴定提供了新的方法。通过提取蛋白质法或菌液直接涂布法，均能准确鉴定圣乔治教堂诺卡菌。但大部分诺卡菌种培养物不易乳化或存在噬琼脂现象，这会增加菌悬液制备难度而影响鉴定准确率，若选取早期培养菌落(菌龄小于48 h)，可提升质谱鉴定率[5]。

诺卡菌感染的首选用药为复方磺胺甲噁唑，必要时可配伍亚胺培南。近年来不断出现诺卡菌耐药现象，特别是磺胺类药物的耐药。此外，CLSI推荐的微量肉汤稀释法在多中心重复性研究中，重复性较低[14]，可能与该药物MIC终点值判断困难有关。通常终点值对应该孔80%菌量被抑制，但在实际操作中，由于诺卡菌浮于药敏孔表面不易判断抑菌量，或判读人员经验不足，极易出现误差。微量肉汤稀释法配合纸片扩散法与E-test法，药敏结果可相互验证，可避免误差[15]。本研究中A151菌株复方磺胺甲噁唑纸片扩散法抑菌圈直径为19 mm，无法判断敏感性，配合微量肉汤稀释法与E-test法，可以确定其MIC值为1 μg/mL/38 μg/mL，依据CLSI M24-A2的折点范围可判断为敏感。依据CLSI标准，复方磺胺甲噁唑的药敏试验使用的磺胺甲噁唑/甲氧苄啶复方配比为19∶1，而临床使用的复方磺胺甲噁唑磺胺甲噁唑/甲氧苄啶配比为5∶1。药敏试验复方配比与临床复方制剂配比不同，可能导致体外药敏结果无法有效预测感染治疗效果。磺胺类药物为浓度依赖型，需要足够的浓度与对氨苯甲酸竞争结合二氢叶酸合成酶，临床用药参考药敏标准时需要酌情考虑使用量。