急性冠状动脉综合征患者血浆miR-375 水平与预后的关系

陆 宏，陶 杰，李家宇

近年来，随着我国人口老龄化进程加快，急性冠状动脉综合征 （acute coronary syndrome，ACS）发病率和死亡率逐年增加，且有年轻化发展趋势［1-2］。随着介入技术发展，经皮冠状动脉介入治疗（PCI）已成为ACS 治疗的主要方法之一［3］，但仍有部分患者发生主要心血管不良事件（MACE）［4］。 因此，探究预判ACS 患者PCI 术后预后的标志物有着重要意义。 微小核糖核酸（microRNA，miRNA，miR）是一种由 18～22 个核苷酸组成的单链非编码 RNA［5］。 目前多数研究报道 miRNA 与 ACS 发病或预后有关［6-7］，如miR-21 与 ACS 斑块稳定性有关［8］。 miR-375 作为miRNA 家族成员，已被报道可抑制Notch 信号通路表达［9］。 众所周知，Notch 信号通路抑制可导致心肌细胞凋亡增加，加剧心脏肥厚和心肌纤维化［10］。 基于上述研究，本研究推测miR-375 靶向Notch 信号通路参与心肌细胞调节，进而影响ACS 患者预后。本研究通过分析miR-375 与ACS 患者预后的关系，以期为预防MACE 发生提供参考。 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2016年3月至 2017年4月在昆明医科大学第一附属医院接受治疗的206 例ACS 患者作为研究对象。 参照《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》［11］诊断 ACS。 患者纳入标准：①首次确诊为ACS；②接受 PCI 治疗；③ACS 发病后 48 h 内入院；④配合完成相关检查；⑤签署知清同意书。 排除标准：①接受冠状动脉旁路移植术治疗；②不接受PCI治疗；③伴有扩张性心肌病、心瓣膜病、肥厚型心肌病；④伴有慢性阻塞性肺疾病、外周血管疾病、胸主动脉瘤、脑卒中、自身免疫性疾病或恶性肿瘤等；⑤肝、肾功能异常；⑥高同型半胱氨酸血症；⑦随访失联。 206 例 ACS 患者中男 134 例，女 72 例；年龄29～69 岁，平均（56.28±9.21）岁。本研究经昆明医科大学第一附属医院医学伦理委员会批准。

1.2 信息收集

收集所有患者年龄、性别、体质指数（BMI）、疾病史（高血压史、高脂血症史、糖尿病史等）、ACS 家族史、ACS 类型［ST 段抬高型心肌梗死（STEMI）、非ST 段抬高型心肌梗死（NSTEMI） 和不稳定心绞痛（unstable angina，UA）］、血管病变位置及支数等信息。

1.3 血浆miR-375 水平检测

采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）法检测 ACS 患者血浆 miR-375 水平［12］。 分别抽取 ACS患者入院24 h 内和PCI 术后7 d 空腹外周静脉血，4 000 r/min 离心15 min，离心半径为8 cm，提取离心后上清液。 将TRIzol 试剂加至装有上清液试管中提取总RNA，用紫外分光光度计检测总RNA 纯度，若A260/A280 在1.8～2.1，则用逆转录试剂盒将其转录成cDNA，最后用PCR 仪扩增cDNA，扩增条件为 95℃ 15 min，94℃ 15 s，55℃ 30 s，70℃ 30 s，共 40 个循环。 内参为 3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH），用 2-DDct 计算 miR-375 水平。 引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 随访与预后评价

采用复诊和电话随访了解ACS 患者预后清况。患者出院后随访3年，每月1 次，末次随访时间为2020年4月 8 日。 本研究将随访中发生 MACE 定义为预后不良。 MACE 包括再发心肌梗死、 不稳定心绞痛、支架内再狭窄、靶血管血运重建及心源性死亡等。

1.5 统计学分析

采用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。 正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较用独立样本t 检验，组内比较用配对样本t 检验。计数资料以例表示，组间比较用χ2检验。 采用受试者工作特征曲线（ROC）评价miR-375 诊断ACS 预后的效能，Kaplan-Meier 法绘制高miR-375 组和低miR-375 组患者生存曲线，Log-Rank 法进行比较。采用Cox 回归法分析影响ACS 预后的因素，限制性立方样条拟合Cox 回归分析miR-375 与ACS 预后的关系，R3.6.3 软件绘制限制性立方样条图。 P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ACS 患者预后清况

206 例 ACS 患者 PCI 术后有 71 例 （34.5%）预后不良，包括再发心肌梗死28 例（13.6%）、不稳定心绞痛 15 例（7.3%）、支架内再狭窄 15 例（7.3%）、靶血管血运重建 9 例（4.4%）、心源性死亡 4 例（1.9%）。

2.2 PCI 术后血浆miR-375 水平变化

根据PCI 术后是否发生MACE，将ACS 患者分为预后不良组（n=71）和预后良好组（n=135）。 两组PCI 术后血浆miR-375 水平均降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；预后不良组PCI 术后血浆miR-375水平高于预后良好组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表 2 ACS 患者 PCI 术前后血浆 miR-375 水平比较

表 2 ACS 患者 PCI 术前后血浆 miR-375 水平比较

组别 术前 术后 t 值 P 值预后不良组（n=71） 4.35±0.79 3.28±0.66 10.039 ＜0.001预后良好组（n=135） 4.28±0.68 2.31±0.64 24.005 ＜0.001 t 值 0.665 10.121 P 值 0.507 ＜0.001

2.3 血浆miR-375 评价ACS 预后的效能

PCI 术后血浆 miR-375 诊断 ACS 预后 ROC曲线下面积、最佳截断点和灵敏度、特异度分别为0.862（95%CI=0.807～0.906）、2.62 和 87.32%、74.81%，PCI 术前血浆miR-375 诊断 ACS 预后 ROC 曲线下面积、 最佳截断点和灵敏度、 特异度分别为0.513（95%CI=0.443～0.583） 和 3.90 和 63.38%、23.70%，PCI 术后血浆 miR-375 诊断 ACS 预后的效能高于PCI 术前血浆miR-375，差异有显著统计学意义（Z=7.046，P＜0.001），见图 1。

图 1 血浆 miR-375 诊断 ACS 预后 ROC 曲线

2.4 两组基线资料比较

根据PCI 术后血浆miR-375 诊断ACS 预后的最佳截断点，将患者分为高miR-375 组（＞2.62，n=96）和低 miR-375 组（≤2.62，n=110）。 两组年龄、性别、BMI、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、ACS 家族史、ACS 类型、病变位置和病变支数比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表 3。

2.5 两组生存清况比较

低 miR-375 组平均生存时间为35.25（34.62～35.88）个月，高于高 miR-375 组［24.22（22.04～26.40）个月］，差异有显著统计学意义（χ2=81.614，P＜0.001）。见图2。

表3 两组基线资料比较

图2 两组生存曲线

2.6 影响ACS 预后的因素分析

将ACS 患者预后作为因变量，年龄、 性别、BMI、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、ACS 家族史、ACS 类型、病变位置、病变支数和miR-375 作为自变量，纳入Cox 单因素回归分析，结果显示高脂血症史、 糖尿病史、ACS 家族史、 病变位置和miR-375与 ACS 预后相关（P＜0.05）。 按纳入标准 P＜0.1 将年龄、高脂血症史、糖尿病史、ACS 家族史、病变位置和miR-375 作为自变量纳入Cox 多因素分析，结果显示ACS 家族史和miR-375 是ACS 预后的独立危险因素（P＜0.05），见表 4。

2.7 血浆miR-375 水平与ACS 预后的关系

采用限制性立方样条拟合Cox 回归法，对ACS 家族史进行调整后分析血浆miR-375 水平与ACS 预后的关系。 通过比较不同节点个数所对应模型Akaike 信息准则（AIC）值，确定节点个数为4 时所对应 AIC 值最小（AIC=628.938）。 分析结果显示血浆miR-375 水平与ACS 预后明显相关（χ2=87.37，P＜0.001），且呈线性关系（非线性检验χ2=4.13，P=0.127）。 以 miR-375 诊断 ACS 预后的最佳截断点为参考点，miR-375 ＜2.62 时，与miR-375=2.62 比较，发生预后不良的风险较低；miR-375＞2.62 时，发生预后不良的风险增加。 见图3。

表4 Cox 回归分析影响ACS 患者预后的因素

图3 miR-375 与ACS 预后的限制性立方样条图

3 讨论

传统ACS 预后预测指标多为C 反应蛋白、血清胱抑素C 及全球急性冠状动脉事件注册研究（GRACE）评分等，但上述指标在ACS 预后评估中价值均有限。 何东旭等［13］研究显示 C 反应蛋白评价ACS 患者预后的ROC 曲线下面积仅为0.634，诊断效能有限。C 反应蛋白在多数炎症性疾病中均表达，单独用来评价ACS 预后特异度较低。 血清胱抑素C和GRACE 评分在ACS 预后评估中的价值也有限。王革等［14］采用血清胱抑素 C 和 GRACE 评分评价ACS 患者预后，结果显示两者诊断 ACS 预后的ROC 曲线下面积分别为0.748 和0.679，诊断效能有限。 因此，还需探究诊断效能较高的生物标志物用于ACS 预后评价。

MiR-375 位于人染色体 2q35 区域 Cryba 2 和Ccdc 108 基因片段上［15］。 目前关于 miR-375 报道越来越多，且已证实与肝细胞肝癌［16］、胃癌［17］、前列腺癌［18］及宫颈癌［19］发病和进展有关。 然而目前尚缺乏关于miR-375 与ACS 患者PCI 后预后关系的研究。本研究通过比较ACS 患者PCI 术前与术后血浆miR-375 水平，发现 ACS 患者 PCI 术后血浆 miR-375 水平降低，预后不良组血浆miR-375 水平高于预后良好组，提示miR-375 可能参与了ACS 发病和进展过程，检测其水平有望预判ACS 预后；通过构建 miR-375 诊断 ACS 预后的 ROC 曲线，发现 PCI术后miR-375 诊断ACS 预后的ROC 曲线下面积、灵敏度、特异度分别为0.862、87.32%、74.81%，表明PCI 术后miR-375 诊断ACS 预后的效能较高，但特异度较低，可辅助评价ACS 预后；通过进一步比较高miR-375 组和低miR-375 组患者生存清况，发现低miR-375 组平均生存时间高于高miR-375 组，进一步证实本研究推测miR-375 参与了ACS 进展，检测其水平可反映ACS 预后；通过Cox 回归法分析影响ACS 预后的相关因素，发现ACS 家族史和miR-375 是ACS 预后的独立危险因素；进一步通过限制性立方样条分析miR-375 与ACS 患者预后的关系，发现miR-375 与ACS 预后不良存在线性关系，且预后不良风险随其水平增加而增加。 上述结果表明miR-375 水平高的ACS 患者预后不良风险较高，应予以密切观察、随访，避免MACE 发生。

Notch 信号转导通路是决定细胞命运的重要信号转导通路之一，参与细胞凋亡、分化及增殖过程，对器官形成和形态有影响作用［20］。 心肌细胞损伤后Notch 信号激活可发挥保护作用［10］。 此外，Notch 信号还与血管内皮损伤后引起的血管内再狭窄有关，Notch 1 信号激活后可促进血管平滑肌细胞增殖和迁移，通过上述机制参与新生内皮增殖过程，进而促使血管再狭窄发生［21-22］。 然而 miR-375 可通过调控Notch 信号通路参与 P19 细胞向心肌细胞分化［10］。 本研究推测miR-375 通过Notch 信号通路，一方面调控心肌细胞凋亡、分化及增殖过程，进而影响心肌纤维化和心肌肥厚，另一方面参与血管内再狭窄过程。 上述病理机制推测仍需实验研究进一步阐明。基于上述推测，检测miR-375 水平可能有助于了解心肌细胞凋亡或纤维化等程度，进而反映ACS 患者预后。

本研究不足之处，一是单中心研究，难免因地域问题对实验结果造成一定偏倚；二是未能动态评估ACS 患者血浆miR-375 水平；三是未开展基础研究阐明miR-375 影响ACS 预后不良的病理机制。下一步将针对不足进行补充，充实本研究内容。

综上所述，ACS 患者PCI 术后血浆miR-375 水平高提示预后不良风险较高，检测PCI 术后ACS 患者血浆miR-375 水平有助于了解预后，避免MACE 发生。