雾化吸入高渗盐水对脓毒症大鼠肺损伤的影响

樊菲菲，谢建刚，赵丹珲，王倩梅，程云会，刘传明

脓毒症是由感染所诱发的全身炎症反应综合征(SIRS)，当宿主对感染反应失调，可引起多器官功能障碍甚至危及生命。肺是脓毒症发生时最容易也是最早被累及的靶器官之一，常表现为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。脓毒症发生时，活化后的免疫调节因子高迁移率族蛋白B1(high-modility groupbox 1, HMGB1)可与Toll样受体4(toll like receptor 4, TLR4)相互作用，通过核因子-κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)引起下游炎性因子释放，加重全身炎症反应。NF-κB的核移位是诱导炎症基因表达的关键环节，在SIRS和急性肺损伤(acute lung injury, ALI)中发挥关键作用，是导致ALI的重要机制[1]。近十年来静脉输入高渗盐水被用于创伤失血性休克的液体复苏；既往研究证实，高渗盐水可通过抑制细胞或大鼠模型的NF-κB-IκB通路影响促炎细胞因子的转录水平[2]。另有文献报道，通过静脉输入高渗盐水可通过抑制HMGB1途径减轻严重烧伤大鼠的肾脏及肠道损伤[3-4]。但在高渗盐水容量复苏过程中，患者容易出现严重心律失常[5]，具有较高的早期病死率及整体病死率，这可能与高渗盐水替代大于约10%的血容量时会对机体凝血功能造成影响有关[5-6]。雾化吸入高渗盐水被用于治疗囊泡性肺间质纤维化和新生儿毛细支气管炎，且对创伤性休克大鼠肺损伤有保护作用[7]。本实验观察了雾化吸入高渗盐水对脓毒症大鼠肺损伤的保护作用，并探讨了其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 选用健康成年SD大鼠30只，体重250 g左右，空军军医大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(陕)2019-001。适应性饲养1周，实验前12 h大鼠禁食不禁水，同时给予肠外营养70 kcal/d。将大鼠随机分为假手术组、模型组、高渗盐雾化组，每组10只。

1.2主要仪器和试剂 超声雾化机购自江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；双光束紫外分光光度计购自上海天美科学仪器有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、IL-1β、髓过氧化物酶(MPO)检测 ELISA试剂盒购自Abcam公司；抗NF-κB p65抗体、抗TLR4抗体、抗HMGB1抗体购自Abcam公司。

1.3脓毒症肺损伤大鼠模型的制备 采用盲肠结扎穿孔法(CLP)制备脓毒症肺损伤大鼠模型，具体操作：用10%水合氯醛麻醉大鼠后下腹正中切口开腹，环形结扎盲肠根部，并在距离盲肠末端约1 cm处切开0.5 cm的切口，挤出粪便后回纳盲肠入腹腔，常规缝合。高渗盐雾化组在脓毒症肺损伤模型制备成功后2 h给予雾化吸入高渗盐水(0.9%氯化钠注射液100 ml加入10%氯化钠注射液30 ml配置成3%高渗盐水130 ml)。假手术组打开腹腔后常规缝合。实验过程中将造模不成功、死亡或因其他原因不符合要求的大鼠剔除；每组缺失大鼠通过随机抽样原则重新补齐，直到整个实验结束。

1.4雾化吸入操作方法 将高渗盐雾化组大鼠分批放入20 cm×30 cm×40 cm大小的玻璃箱中，用钻孔器在玻璃箱前方正中开凿一个直径为2 cm的孔径作为雾化进气孔，在玻璃箱后方靠边界处开凿一个直径约0.5 cm的孔径作为排气孔，将3%高渗盐水10 ml加入超声雾化器中，每次雾化吸入15 min，2次间隔3 h。术后正常进食水，分别在雾化吸入6、24 h时处死大鼠。

1.5肺组织病理改变 将大鼠麻醉处死后，以4%多聚甲醛溶液固定肺组织，在不同部位取3块肺组织，依次以乙醇脱水，石蜡包埋、切片、脱蜡、染色，以肺泡壁毛细血管扩张充血程度、肺泡间隙增宽及炎性细胞渗出程度进行病理学评价。每只大鼠取4张切片，每张切片观察6个不同视野，分别记录病理学评分，最后取平均值。

1.6肺组织湿干重比(W/D)和MPO测定 切取3组大鼠右肺，试纸吸干肺组织表面血液及黏液后称重记录湿重；然后60℃烘干24 h称重记录干重，计算W/D比值。准确称取肺组织，磷酸盐缓冲液制备5%肺组织匀浆，40 000 r/min，30 min高速离心，弃上清，再加入磷酸盐缓冲液超声预处理90 s，37℃水浴15 min后再次离心，分光光度计测量样本在490 nm处OD值，根据OD值换算MPO活性。

1.7血清炎性因子水平测定 取3组大鼠左心室血1 ml，放置室温2 h，1000 r/min，20 min离心，取上清液置于-20℃保存，使用时逐渐恢复至20℃，与标准品混合，按ELISA试剂盒上的protocol操作。酶标仪450 nm比色，与标准品对应的比色值比较，计算大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量。

1.8肺组织NF-κB、TLR4、HMGB1表达测定 取3组大鼠右肺，将肺组织放入匀浆器中充分研磨后，加入PMSF裂解液，于冰上孵育30 min后，以4℃，12 000 r/min，5 min高速离心后取上清，用蛋白标准品将样本蛋白标准化，再按蛋白抽提试剂盒上protocol抽提细胞质蛋白和核蛋白，经电泳、转膜、分别加入NF-κB、TLR4、HMGB1一抗、孵育过夜、加入二抗孵育1 h后显色定影，最后用Image-Pro Plus软件分析目的蛋白条带灰度值/内参(β-actin)值。

2 结果

2.1肺组织病理学表现 假手术组支气管结构清楚，肺间质可见少量炎性细胞浸润，微血管无充血，肺泡内无渗出。模型组肺泡腔内大量渗出，肺泡间明显增宽、塌陷，肺间质内浸润大量炎性细胞，微血管充血、淤血。高渗盐雾化组肺间质炎性细胞浸润较模型组减少，微血管淤血程度明显减轻。见图1。

图1 3组大鼠肺组织病理学表现(SP×400)

2.2肺组织损伤指标比较 与假手术组比较，模型组肺组织病理学评分、肺组织W/D值、MPO显著升高(P<0.01)；与模型组比较，高渗盐雾化组肺组织病理学评分、肺组织W/D值、MPO显著降低(P<0.01)。见表1、图2。

图2 3组大鼠肺组织损伤指标比较

表1 3组大鼠肺组织损伤指标比较

2.3血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较 与假手术组比较，模型组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著升高(P<0.01，P<0.05)；与模型组比较，高渗盐雾化组血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著下降(P<0.01，P<0.05)。见表2、图3。

图3 3组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

表2 3组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比较

2.4肺组织NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表达水平比较 与假手术组比较，模型组HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著升高(P<0.01)；与模型组比较，高渗盐雾化组HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达水平显著下降(P<0.05，P<0.01)。见表3、图4。

图4 3组大鼠肺组织NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表达水平比较

表3 3组大鼠肺组织NF-κB、TLR4、HMGB1蛋白表达比较

3 讨论

脓毒症继发ALI的发病机制十分复杂，主要病理生理学改变为肺部多种炎性细胞浸润、移位，促炎因子和抗炎因子的表达改变；血管通透性增大，炎性分泌物产生，透明膜形成及凝血功能异常等[8]；引起肺顺应性下降和通气/血流比例失调[9]，导致通气功能障碍，临床表现为顽固性低氧血症和肺部渗出的增加[10]。生理状态下，肺间质、细支气管及肺泡间隔中存在中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞，可吞噬进入下呼吸道的感染性、毒性及致敏性物质[11]。HMGB1和NF-κB广泛存在于细胞核内，HMGB1可稳定核染色体和调控蛋白转录、翻译；NF-κB是核转录调节蛋白的一种，负责前炎性因子和细胞生存基因的表达，在生理状态下NF-κB与有抑制作用的IκB结合[12]。

既往研究证明，脓毒症时大量炎性因子及内毒素释放入血，诱导肺组织内中性粒细胞聚集、活化、释放、延迟凋亡；同时促进巨噬细胞大量释放HMGB1，当HMGB1与其内源性配体TLR4在细胞外结合后会进一步激活MyD88依赖性途径[13-14]。在炎性因子作用下，IκB磷酸化后活化，NF-κB与IkB形成的三聚体会发生降解，导致NF-κB脱离并激活，被激活的NF-κB能迅速到达细胞核的位置发挥自身作用；当HMGB1/TLR4/NF-κB/IκB信号通路被激活后会产生大量的IL-1β、IL-6、细胞因子和趋化因子、前炎性介质(如TNF-α)等[15]。炎性因子和前炎性因子可直接损伤肺血管内皮细胞，增加内皮细胞的通透性，造成肺水肿；同时能刺激中性粒细胞释放炎性介质和正反馈促进HMGB1分泌，激发机体炎症级联反应从而加重ALI[16]。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组肺泡腔内大量渗出，肺泡间明显增宽、塌陷，肺间质内浸润大量的炎性细胞，微血管充血淤血等病理学改变；且模型组肺W/D值、肺组织中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达水平及血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平均显著增加。说明脓毒症可增加肺部炎症浸润程度；HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路被激活在脓毒症肺损伤的发生和发展中起到重要作用。

雾化吸入高渗盐水在临床上多用于治疗囊泡性纤维症和新生儿细支气管炎，可能是通过减轻肺泡巨噬细胞活化、中性粒细胞聚集及细胞表面黏附因子表达来实现；同时提高气道表面液体水平，改善气道黏膜纤毛运输效力[17]。小剂量静脉输入高渗盐水溶液也用于失血及创伤性休克的液体复苏。Mitra等[18]发现高渗盐水可减少复苏所需的液体量；还在模型细胞及模型动物水平上证实了高渗盐水可通过抑制NF-κB-IκB通路影响几种促炎细胞因子转录，从而起到保护作用。Wohlauer等[7]报道，在失血性休克动物模型中，早期容量复苏时，应用雾化吸入高渗盐水的措施，可通过减少内皮细胞释放炎性前介质而起到减轻ALI的目的；其作用机制是在不改变中性粒细胞肺内聚集情况下，降低了基质金属蛋白酶-13表达，保证了终末气道肺泡基膜的完整性；基质金属蛋白酶-13已被证实与由败血症引起的ALI发展关联。本实验结果显示，高渗盐雾化组肺部炎症程度、肺部W/D明显减轻，血清IL-1β、IL-6、TNF-α表达及肺组织中HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表达均下降，证实了雾化吸入高渗盐水可能是通过HMGB1/TLR4/NF-κB途径起到减轻肺部炎症的作用。

雾化吸入高渗盐水治疗脓毒症肺损伤效果好，鉴于该方法在临床已应用于其他肺部疾病，安全性好且价格低廉，今后可在临床推广，以期为脓毒症的治疗提供更多有效方法。