LncRNA-ATB在胃癌细胞中的表达及体外功能实验研究

智亮辉，刘 伟，李 伟，甄四虎，焦喜林

在世界范围内，胃癌是第二大癌症相关致死性疾病[1],在我国是继肺癌、肝癌后的第三大高发恶性肿瘤，预后差、病死率高，严重威胁了我国人民的生命健康[2]。胃癌的演化进程涉及多种致癌基因激活、抑癌基因失活和复杂分子调控机制[3]。近年来靶向药物、生物治疗、免疫治疗等取得了一定进展，然而胃癌患者的整体5年生存率仍然徘徊在20%左右[4]，且中晚期患者居多，预后差。因此寻找新的胃癌演化进程中有效靶点用于临床诊断，评估预后，开发相应作用靶点的药物是目前亟待解决的问题，对于提高胃癌患者的临床诊治水平和长期生存有重大意义。本课题组前期研究发现LncRNA-ATB在胃癌中高表达且提示患者预后不良，但其具体功能及作用机制尚需深入研究。现报告如下。

1 材料和方法

1.1实验细胞和试剂 人胃癌细胞系BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS及人正常胃黏膜上皮细胞GES1购自中国科学院上海细胞库。RNA提取及反转录试剂盒分别购自美国Thermo Fisher公司、日本TaKaRa公司，荧光实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂盒SYBRPremix Ex Taq TMⅡ购自日本TaKaRa公司，LncRNAATB-siRNA和NC由Invitrogen公司设计并合成(敲低组设计si1、si2、si3共3条)，Lipofectamine TM 2000转染试剂和Transwell小室分别购自购于美国Invitrogen公司及Corning公司，胎牛血清、RPMI-1640培养基、0.25%胰酶、Penicillin-Streptomycin双抗购于美国Hyclon公司，RIPA高效蛋白裂解液购自美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和筛选:胃癌细胞(BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS)及人正常胃黏膜上皮细胞GES1均采用含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI-1640培养基置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每2～3天传代一次，选取对数生长期细胞进行实验。待细胞80%融合后，收集细胞，用Trizol 裂解细胞，分别提取细胞总RNA，反转录cDNA为模板。lncRNA-ATB引物序列为：上游5-CTTCACCAGCACCCAGAGA-3，下游5-AAGACAGAAAAACAGTTCCGAGTC-3；内参GAPDH引物序列为：上游5-TTGGTATCGTGGAAGGACTC-3A，下游5-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3。qRT-PCR反应条件为：95℃预变性 45 s，75℃ 15 s，60℃ 30 s，35个循环，实验重复3次。记录各组反应Ct值，以2-ΔΔCt表示待测基因的表达水平。

1.2.2细胞转染及鉴定:选取BGC-823和MGC-803胃癌细胞系进行后续功能研究，分为对照(NC)组，si1、si2、si3组。培养细胞3～5 d，于转染前12 h将细胞悬液种植于六孔板中，待细胞融合度达到30%左右时进行实验，取4个EP管，分别加入200 μl无牛血清无双抗培养基，取2管加入3 μl转染试剂lipo 2000，轻轻摇晃混匀；另2管分别加入LncRNA-ATB-shRNA/NC，摇晃混匀，常温放置5 min。将LncRNA-ATB-shRNA/NC和lipo 2000混在一起，轻轻摇晃混匀，常温放置15 min。将六孔板中待转染的细胞换成无牛血清无双抗培养基，将上述混合液按分组加入六孔板中，轻轻摇晃混匀，培养8 h后取出，换成含牛血清含双抗培养基。48 h后收取细胞提取 RNA，鉴定转染效率。构建瞬时转染敲低lncRNA-ATB的胃癌细胞系。

1.2.3细胞侵袭和迁移：Transwell 小室实验检测胃癌细胞的侵袭和迁移能力。实验前1天用 Matrigel基质胶覆盖小室上室的基底膜，在培养箱过夜。实验时将转染后细胞悬浮，每个小室上室加入密度为 1×105个/ml细胞悬液200 μl，下室加入500 μl含20%牛血清的培养基，培养48～72 h后，取出小室，用PBS冲洗2遍，并用棉签轻轻擦去上室底层的残余细胞及培养基，用10%甲醛固定细胞5 min，结晶紫溶液染色15 min，自来水冲洗，放置于倒置显微镜下，随机选取3个视野,计数染色细胞的平均值进行统计学分析。迁移实验时，Transwell小室的上室基底膜无需Matrigel 覆盖基质胶，其他步骤与细胞侵袭实验相同。

1.2.4细胞克隆：将转染后细胞接种于六孔板中，每孔接种1000个细胞，设置3个复孔。培养10 d，每2～3天换液一次。第10天取出细胞，用PBS冲洗2遍，加入10%甲醛固定5 min。弃甲醛，加入结晶紫溶液常温下染色15 min。然后用自来水缓慢冲洗培养板，将结晶紫洗净，室温晾干，拍照计数染色细胞，进行统计学分析。

1.2.5细胞增殖：在96孔板中分别接种BGC-823和MGC-803细胞(每孔3000个细胞)，分为实验组(si2、si3)及对照组(NC)，每组设5个复孔，分别于0、24、48、72、96 h用CCK-8 法检测BGC-823和MGC-803细胞的增殖情况，避光加入10 μl CCK-8(5 mg/ml)，在培养箱中孵育2 h。使用酶标仪测定细胞OD值，计算每组平均值，重复3次。

2 结果

2.1lncRNA-ATB在正常胃和胃癌细胞系中的表达水平 与正常胃黏膜上皮细胞GES1相比，lncRNA-ATB在胃癌细胞BGC-823、MGC-803、SGC-7901、AGS表达均显著升高(P<0.05)。见图1。本实验选取升高差异最明显的BGC-823和MGC-803进行后续研究。

图1 GES1和MGC-803、BGC-823、SGC-7901、AGS细胞lncRNA-ATB表达水平比较

2.2构建稳转细胞系及鉴定 si2、si3组BGC-823细胞lncRNA-ATB表达水平分别为0.43±0.29、0.32±0.26；si2、si3组lncRNA-ATB表达水平显著低于NC组(P<0.05)。si2、si3组MGC-803细胞lncRNA-ATB表达水平分别为0.45±0.23、0.25±0.14，si2、si3组lncRNA-ATB表达水平显著低于NC组(P<0.05)。见图2。因此后续功能实验选取si2、si3作为对照组进行。

图2 MGC-803、BGC-823细胞lncRNA-ATB表达水平比较

2.3敲低lncRNA-ATB后对胃癌细胞迁移、侵袭能力的影响

2.3.1对BCG-823细胞迁移、侵袭能力影响：迁移实验中NC组、si2组和si3组BCG-823细胞计数分别为200.00±10.44、75.00±9.52、48.00±7.56；与NC组相比，si2组和si3组BCG-823细胞计数显著降低(P<0.05)。侵袭实验中NC组、si2组和si3组BCG-823细胞计数分别为175.00±12.31、54.00±8.55、47.00±6.74；与NC组相比，si2组和si3组BCG-823细胞计数显著降低(P<0.05)。见图3。

图3 敲低lncRNA-ATB后对BGC-823体外迁移侵袭能力的影响

2.3.2对MGC-803细胞迁移、侵袭能力影响：迁移实验中NC组、si2组和si3组BCG-803细胞计数分别为195.00±9.88、54.00±7.61、47.00±8.32；与NC组比较，si2组和si3组BCG-803细胞计数显著降低(P<0.05)。侵袭实验中NC组、si2组和si3组的BCG-803细胞计数分别为173.00±7.36、48.00±7.57、45.00±6.83；与NC组相比，si2转染组和si3转染组BCG-803细胞计数显著降低(P<0.05)。见图4。

图4 敲低lncRNA-ATB后对胃癌细胞MGC-803体外迁移侵袭能力的影响

2.4敲低lncRNA-ATB后胃癌细胞克隆能力变化的比较 NG组、si2组、si3组BGC-823细胞克隆集落生长数目分别为785.00±5.02、213.00±7.82、195.00±4.24。与NC组比较，si2组、si3组BGC-823细胞克隆集落生长数目显著减少(P<0.01)。NC组、si2组、si3组MGC-803细胞克隆集落生长数目分别为812.00±12.35、205.30±12.32、195.00±15.47。与NC组比较，si2组、si3组MGC-803细胞克隆集落生长数目显著减少(P<0.01)。见图5。

图5 敲低lncRNA-ATB后对BGC-823和MGC-803细胞克隆形成能力影响

2.5敲低lncRNA-ATB后对胃癌细胞增殖能力的影响 与NC组比较，si2组和si3组BGC-823、MGC-80细胞增殖能力显著降低(P<0.05)。见图6。

图6 敲低lncRNA-ATB后对BGC-823和MGC-803细胞增殖能力的影响

3 讨论

人类全基因组中，只有2%的基因可以编码蛋白，其他基因均转录为非编码RNA[5-6]。非编码RNA根据长度分为：小ncRNA(<200 nt)及 lncRNA(>200 nt)。lncRNA 由于长度及结构原因，其高级结构决定了其重要功能[7]。既往多个研究表明，lncRNA广泛在多个细胞分子事件中参与肿瘤细胞的恶性生物学行为，在复杂的分子生物调控网络中发挥重要作用[7]。国内外研究证实，lncRNA在各种癌症中广泛表达，具有肿瘤特异性及表达多样性[8-9]。研究表明，多种lncRNA 在胃癌演化进程的重要节点存在异常表达，与胃癌的异常分化、迁移、侵袭等恶性生物学行为密切相关，并能指导患者预后，在患者术后监测辅助治疗效果判断方面有重要意义[10-11]。如：SNHG5在胃癌发生发展过程中发挥抑癌作用[12]；GClnc1在胃癌的进展中发挥促癌作用[13]；HOTAIR、lncRNA-H19促进胃癌细胞的侵袭转移[14-15]。研究表明lncRNA-ATB与恶性肿瘤的发生发展密切相关，广泛参与了恶性肿瘤细胞的多个分子事件[16]，其在结直肠癌和肝癌的发展进程中发挥重要作用[17-18]。但lncRNA-ATB在胃癌中的具体功能尚未见研究报道。

侵袭转移是恶性肿瘤特有的生物学行为，也是肿瘤复发致死的主要原因，因此探寻肿瘤细胞发生迁移侵袭的相关癌基因有重大意义。本课题组首先采用qPCR在4种胃癌细胞系中验证了lncRNA-ATB的表达水平，筛选出高表达lncRNA-ATB的两种胃癌细胞系BGC-823和MGC-803进行后续功能实验。设计LncRNA-ATB-shRNA/NC干扰序列，构建瞬时转染敲低lncRNA-ATB的胃癌细胞系。采用qPCR技术进行验证，选取敲低效果较好的si2和si3进行后续实验。本实验结果显示，敲低lncRNA-ATB后si2组、si3组BGC-823、MGC-803迁移、侵袭能力较NC组明显降低。提示lncRNA-ATB对胃癌的迁移、侵袭能力有促进作用。本实验结果同时表明，敲低lncRNA-ATB后si2组、si3组BGC-823、MGC-803细胞克隆能力和增殖能力较NC组显著降低。上述实验结果表明lncRNA-ATB在体外发挥癌基因的作用，促进胃癌细胞的增殖、迁移侵袭能力。但具体机制有待进一步研究。

综上所述，lncRNA-ATB在体外对胃癌细胞的恶性生物学行为发挥重要的调控作用，对胃癌进展有重要的促进作用，但是其具体作用机制仍有待深入研究。