鼠神经生长因子对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤后巢蛋白表达的影响

许锋，姚文静，曹春霞，薛媛媛，李玉运，马立吉，付海波

淄博市中心医院儿科，山东 淄博 255036

新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxia-ischemia brain damage，HIBD)是围生期缺氧或窒息后引起的脑神经损伤性疾病。据统计，我国新生儿HIBD发生率为活产儿的0.3%～0.6%，其中15%～20%在新生儿期死亡，存活者中20%～30%可能遗留不同程度的神经系统后遗症。目前对于新生儿HIBD 治疗措施，主要是早期是维持内环境稳定，后期行康复训练，国内外尚无值得肯定药物干预措施。鼠神经生长因子(mouse nerve growth factor，mNGF)作为一种具有神经修复功能生物活性蛋白，已广泛应用于眼科、骨科、神经科等领域。近年来，已有报道mNGF 用于新生儿HIBD 康复治疗，治疗效果仍不确切。巢蛋白(nestin)作为于神经干细胞(neural stem cells，NSCs)特异性抗原，在受损的神经部位广泛表达，常作为NSCs 增殖再生研究的标志物。本研究利用新生大鼠HIBD 模型，观察脑海马部位nestin 阳性细胞个数变化，以探讨mNGF 的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物和分组 108 只7 d 龄Wistar 大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)体质量(15.4±2.2) g，雌雄不限；按完全随机法原则分为对照组、HIBD组和治疗组，每组36只。

1.1.2 主要试剂 兔抗鼠nestin 多克隆抗体(上海科敏生物科技有限公司)；兔IgG 抗体-HRP 多聚体(武汉博士德生物工程有限公司)；注射用mNGF [舒泰神(北京)生物制药股份有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠HIBD模型制作方法 参照文献[1]，阻断左侧颈总动脉，术后立即置于缺氧舱(50 cm×60 cm×60 cm，有两个直径为3 cm圆孔与外界相通，并放置钠石灰吸收水和二氧化碳)，8%的氮氧混合气体低氧暴露2 h。对照组仅暴露游离左侧颈总动脉，不做缺氧缺血处理。

1.2.2 干预措施 治疗组HIBD后于左侧股二头肌部位肌肉注射mNGF [10 μg/(kg·d)]，连用3 d；对照组、HIBD 组在相同时间点相同部位仅肌肉注射等容积生理盐水。

1.2.3 标本采集和组织切片的制备 三组大鼠术后4 d、7 d、14 d 用4%多聚甲醛穿心灌注处死后留取脑组织标本，室温固定24 h，石蜡包埋，在海马部位连续切片，片厚4 μm，隔4取1，制作免疫组织化学和HE染色切片。以1∶200兔抗鼠nestin多克隆抗体为一抗，行免疫组织化学非生物素二步法及常规HE染色。

1.2.4 数据采集与处理 在Olympus CX33 显微镜下，利用计算机细胞图像分析技术完成图像采集表及nestin阳性细胞计数。细胞胞浆内会出现棕红色或褐色颗粒为nestin 阳性细胞。取计数5 个非连续脑组织切片nestin 阳性细胞，以平均值作为该只大鼠阳性细胞计数。

1.3 统计学方法 数据利用SPSS21.0 自动统计分析软件进行处理，三组不同时点nestin 阳性细胞个数的计量资料均符合正态分布，以均数±标准差(±s)表示。组间两两比较采用独立样本t 检验，三组间比较、同组内不同亚组比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织HE染色病理改变 对照组大鼠海马部位锥体细胞排列整齐、密集；HIBD组大鼠海马部位锥体细胞排列紊乱，可见单个细胞与周围的细胞分离，核染色质浓集呈蓝色致密的球状，可见较多凋亡的神经细胞；治疗组可见海马部位锥体细胞层次排列较整齐，胞质浓缩，嗜酸性增强，可见少量凋亡的神经细胞(图1)。

图1 三组大鼠术后7 d海马部位病理改变(HE染色，×400)

2.2 海马DG区nestin表达 通常nestin染色阳性细胞呈棕红色或褐色，着色点位于细胞体和突起部分；阴性对照片无相应的nestin免疫反应产物。HIBD组同时点nestin阳性细胞数较对照组增多，差异均有统计学意义(P＜0.05)；治疗组同时点nestin阳性细胞数较对照组、HIBD组均增多，差异均有统计学意义(P＜0.05)；nestin阳性细胞数术后7 d达高峰，术后14 d有所降低，各时点比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表1和图2。

图2 三组大鼠术后7 d海马部位nestin表达(非生物素二步法，×400)

表1 三组大鼠不同时点海马DG区nestin阳性细胞数比较(±s，个)

表1 三组大鼠不同时点海马DG区nestin阳性细胞数比较(±s，个)

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3 讨论

NSCs 存在于中枢神经系统中，具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的潜能，在神经损伤修复过程中发挥一定作用。在脑组织内侧脑室下区(subventricular zone，SVZ) 及 海 马 齿 状 回(dentate gyrus，DG)区是NSCs主要的聚集区域[2]，故作为NSCs的特征性标记物nestin 在SVZ 和DG 区有强表达。本研究以海马DG区nestin阳性细胞个数作为研究对象，来观察内源性NSCs的增殖情况。

研究发现新生大鼠HIBD 后脑组织DG 区及SVZ可见少量增殖的NSCs[3]，提示HIBD 本身可促进内源性NSCs 增殖。本研究发现新生Wistar 大鼠HIBD 组DG区nestin阳性细胞个数较对照组各时点均增多，差异有统计学意义，且在术后7 d 达高峰。由此推测HIBD可诱导内源性NSCs的增殖与再生，这与以前研究结果是一致的[4]。

本研究还发现，经mNGF 干预后的新生Wistar 大鼠HIBD模型，在各时点脑组织DG区nestin阳性细胞个数较HIBD组、对照组均明显增多，且差异有统计学意义。提示mNGF 可能促进内源性NSCs 的增殖再生，在新生大鼠HIBD 后发挥一定的神经修复作用。已知mNGF 是一种分子量为26.5 kD 的生物活性蛋白，是在神经系统生长、分化及功能维持中发挥重要作用的一种细胞因子。mNGF具有维持神经系统正常发育和功能的作用[5]，对神经元有营养支持作用，且能够促进受损神经组织的修复[6]。研究发现应用mNGF体外诱导脐血间充质干细胞，可以诱导脐血间充质干细胞分化成类神经元和神经胶质细胞[7]。还有研究表明mNGF能诱导NSCs向类神经元分化[8]，对受损神经有修复保护作用[9]。对于mNGF具体的生物学效应机制，目前尚未完全清楚，可能与TrkA 受体[10]和神经营养素受体p75NTR[11-13]有相关性。此外，mNGF也可以通过激活ERK1/2和P13K/Akt通路来促进神经元的分化、存活[14]，对神经元间联系及损伤后神经元的修复也有生物学效应[15]。目前mNGF 已广泛应用于眼科、骨科、神经科、儿科等领域，对于脑瘫、缺氧缺血性脑损伤、面神经炎、周围神经损伤等多种疾病的治疗，均取得较好疗效[16-19]。

总之，本研究已证实mNGF 可促进新生大鼠HIBD 后nestin 表达增加，可能促NSCs 的增殖、分化，为临床应用mNGF治疗新生儿HIBD提供了新的实验依据。但具体作用机制及增殖后NSCs是否具有生物学功能有待于进一步研究探讨。