糖尿病足溃疡相关基因与免疫细胞特征分析

周 晗，杨晓笙，廖陈龙，张文川

上海交通大学医学院附属第九人民医院神经外科，上海 200011

2019 年，约有4.63 亿成年人患糖尿病（diabetes mellitus，DM），这一数字在2045 年预计将超过7 亿[1]。糖尿病足溃疡（diabetic foot ulceration，DFU）是最常见且医疗负担最高的DM 并发症之一，DFU 患者约占DM 患者的15%[2]。随着DM 患病人数的增加和DM 患者预期寿命的延长，DFU 患者的数量将持续增加[3]。DFU 患者面临复发和截肢的高风险，并承受着巨大的经济负担。DFU 的病因复杂多样[4]，周围神经病变、周围动脉疾病和重复性创伤被认为是主要诱发因素。与正常伤口愈合相比，DM患者伤口愈合过程中受到高血糖、慢性炎症、缺氧和神经肽信号转导受损的影响[4]，造成伤口愈合不良，最终可能导致慢性开放性溃疡[5]。此外，DM 患者的免疫反应和对感染的抵抗力也发生了改变[6]。因此，有必要了解DFU发生过程中的潜在分子机制，并确定更具体有效的治疗干预措施。

近年来，DFU 的分子生物学机制研究已取得一些成果。Nguyen 等[7]研究发现活性基质金属蛋白酶-9（matrix metalloprotein-9，MMP-9）上调是DM 小鼠伤口难以愈合的原因，并证明其抑制剂（R）-ND-336 较贝卡普勒明（becaplermin，一种现有的经美国食品药品监督管理局批准的DFU 药物）对伤口愈合更有效。Sunkari 等[8]提出，缺氧诱导因子1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）的激活有助于改善DM 小鼠的伤口愈合。Icli 等[9]指出，miRNA-26a 可以显著提高DM 小鼠伤口愈合的速度。Ramirez等[10]利用基因表达谱芯片研究发现，金黄色葡萄球菌诱导的DFU 中miR-15b-5p 上调，并在进一步的实验中证实其对DNA 修复和炎症反应的抑制作用。

在本研究中，GSE80178 的芯片数据下载于美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI） 基 因 表 达 综 合 数 据 库（Gene Expression Omnibus，GEO）。通过这些数据来鉴定DFU与糖尿病足皮肤（diabetic foot skin，DFS）的差异表达基因（differentially expressed genes，DEG）及其生物学功能，并基于反卷积算法（CIBERSORTx）[11]探索影响DFU 发展的免疫细胞，旨在为DFU 靶向治疗药物的开发提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 芯片数据和预处理

mRNA 数据集GSE80178 下载自GEO 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）。 该 数 据 集 的 建 立 基 于GPL16686（Affymetrix Human Gene）平台[10]，共包含12 个独立样本，包括6 个DFU 样本、3 个DFS 样本和3 个非糖尿病足部皮肤（non-diabetic foot skin，nDFS）样本，即正常人皮肤样本。通过R 语言中的oligo 软件包[12]读取CEL文件探针级数据。原始表达数据使用RMA（Robust Multi-Array Average）算法[13]进行背景校正，log2转换及归一化。

1.2 差异基因筛选和功能富集分析

利用R 语言中的limma 包来鉴别DEG，且以P ＜ 0.05、log2|Fold Change|（log2|FC|） ＞1 用作截断标准。为探索DEG 涉及的基因功能，我们将DEG 提交给DAVID（Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery）数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行注释与聚类[14-15]。基因功能的可视化是使用GOplot 程序包[16]生成的。对应的筛选标准为P＜0.05，基因计数＞5。

1.3 免疫细胞分析

CIBERSORTx 提供了一种反卷积算法，可根据基因表达数据估算混合细胞群中成员细胞类型的丰度。利用该算法及其提供的22 种免疫细胞的547 个标记基因，对12 个样本进行反卷积分析，推断22 种免疫细胞在nDFS、DFS 及DFU 的相对含量，并通过Wilcoxon 秩和检验分析了nDFS、DFS 与DFU 之间各种免疫细胞比例的差异。使用R 语言的vioplot 软件包绘制小提琴图以可视化22 种浸润免疫细胞的比例差异。

2 结果

2.1 DFU 与DFS 之间DEG 鉴别

经RMA 算法预处理后，所有样品的基因表达平均值处于同一水平，以P＜0.05 和log2|FC|＞2 为标准，共获得296 个DFU 与DFS 之间的DEG。火山图中显示了80 个上调基因和216 个下调基因（图1A）。按log2|FC| 排序，并在热图中展示前5 个上调和下调基因（图1B），这10个基因的具体信息见表1。

图1 DFU 和DFS 之间的DEGFig 1 DEGs between DFU and DFS

表1 DFU 和DFS 之间上调和下调的前5 位DEGTab 1 Top 5 up-regulated and down-regulated DEGs between DFU and DFS

2.2 功能注释与富集分析

以基因本体论（Gene Ontology，GO）注释了DFU 和DFS 之间DEG 所代表的生物学特征（表2）。以P＜0.05、基因计数＞5 为筛选条件，筛选出3 个下调和11 个上调的生物过程，以及5 个下调和3 个上调的细胞成分。角质形成细胞的分化、角质化、肽交联、表皮发育、中性粒细胞趋化性等生物过程在DFU 组上调，下调的生物过程包括来自于RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、轴突导向和细胞黏附。在细胞成分类别中，DEG 主要集中在外泌体和细胞外空间。

表2 GO 分析DEG 的生物过程与细胞成分Tab 2 Biological process and cellular component of DEGs

2.3 nDFS、DFS 及DFU 中的免疫细胞分析

通 过CIBERSORTx 算 法，从6 个DFU 样 品 和3 个DFS 样品中获得22 种免疫细胞的比例。与DFS 相比，DFU 中CD8+T 细胞、单核细胞、静息自然杀伤细胞（NK 细胞）和活化的肥大细胞比例增加，而静息肥大细胞和活化的NK 细胞的比例降低（图2）。

图2 DFU、DFS 和nDFS 中免疫细胞的相对比例Fig 2 Relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

图3 DFU、DFS 和nDFS 中免疫细胞相对比例的比较Fig 3 Comparation of the relative proportions of immune cells in DFU, DFS and nDFS

为进一步验证在DFU 发生前后各免疫细胞比例差异是否具有统计学意义，采用Wilcoxon 秩和检验分别对nDFS 与DFS 组、DFS 与DFU 进行比较。如图3 所示，nDFS 与DFS 组间，未发现差异具有统计学意义的免疫细胞（均P ＞0.05）；DFS 组与DFU 组间，DFU 中CD8+T 细胞、单核细胞、活化的肥大细胞和静息NK 细胞比例显著升高，而活化的NK 细胞和静息肥大细胞比例显著降 低。

3 讨论

DFU 是DM 的常见并发症，每年影响全球2 610 万人[2]。DFU 的复发及因其导致的截肢是该疾病的主要难题。年复发率估计为22.1%[17]，截肢的年发生率为0.25%～1.80%，截肢后1 年的死亡率为44%[18-19]。尽管最近研究人员对DFU 发病机制展开了一些研究，但是目前对其的了解仍相对有限，因此有必要对其发病机制进行 更深入的了解以寻找潜在的治疗靶点，提供更多的治疗选择。

本研究通过生物信息学方法分析了DFU 和DFS 的表达谱数据集。总共鉴定出80 个上调基因和216 个下调基因，用于后续的GO 功能富集。在前5 个上调的基因中，S100A12 参与先天免疫应答的抗微生物感染，发挥细胞因子和趋化因子的作用，并可募集大量白细胞[20]；MMP-1 在伤口愈合过程所涉及的细胞迁移、上皮化和组织修复中起重要作用[21-22]；SPRR2B 和SPRR2F 编码的蛋白质是角质化包膜的组成部分，是对抗细胞外和环境因素的屏障[23]。由此推测，DFU 组织中先天免疫应答、抗菌功能以及特定的角质形成有所增强。在前5 个下调的基因中，KRT2、DCD 和FLG2 或可作为潜在的治疗靶点。KRT2 编码在表皮角质形成细胞的上棘层中表达的结构蛋白，KRT2 缺乏会导致角化过度，并引起局部炎症[24-25]。DCD 编码的C 端肽具有抗菌和抗真菌活性[26]。FLG2 蛋白可以为皮肤提供物理屏障，并且该蛋白的C 端片段具有抗菌作用。推测DCD 和FLG2 的显著下调可能与DFU 复发有关。其他3个基因HEPHL-1、TYRP1 和PIP 在DFU 中的作用有待进一步的研究。

GO 分析用于了解这些DEG 编码蛋白可能涉及的生物过程和细胞成分。基底角质形成细胞的增殖和迁移是皮肤溃疡恢复的关键因素[27]。在DFU 样品，角质形成细胞的分化、角质化、肽交联和表皮发育表现活跃。角质形成细胞不仅提供物理屏障来预防细菌感染，而且还通过产生抗菌肽、炎症细胞因子和趋化因子来促进早期免疫反应[28]。此外，与免疫相关的过程，例如中性粒细胞趋化性和对细菌的防御反应、炎症反应也有所增强。其他上调的生物过程包括血管生成的正调控、凋亡过程的正调控和细胞增殖的正调控。由这些上调的生物过程推测，DFU 局部皮肤正在进行主动表皮和血管修复和主动的炎症反应，以及增强抗菌功能。下调的生物过程包括来自于RNA 聚合酶Ⅱ启动子的转录负调控、轴突导向和细胞黏附。在细胞成分类别中DEG 主要集中在外泌体和细胞外空间，因此DFU 中的细胞外微环境和细胞之间的信息传递值得研究者关注。

根据上述研究结果推测，DFU 的形成可能伴随着免疫微环境的改变。因此，本研究应用CIBERSORTx 对DFU 发生前后各种免疫细胞的浸润比例进行了全面评估。结果发现，在DFS 和nDFS 中各免疫细胞比例差异均无统计学意义，这与先前的研究[29]结果一致。因此，推测DM 患者皮肤对溃疡的敏感性可能不是由于局部免疫微环境的改变，即在溃疡发生前DM 患者皮肤局部免疫微环境改变并不明显。而在DFU 和DFS 的对比中我们发现，活化的肥大细胞、静息NK 细胞、CD8+T 细胞、单核细胞比例增加。

肥大细胞参与伤口愈合过程中的炎症反应、血管生成和细胞外基质重吸收[30]。DFU 组中活化的肥大细胞比例显著增加，而静息肥大细胞比例显著下降。该差异反映了DFU 中肥大细胞可能被激活，脱颗粒；而最近的研究表明，这种现象不利于伤口愈合。Tellechea 等[31]报道了在损伤之前或之后，局部应用肥大细胞脱颗粒抑制剂MCS- 01 可以加速DM 小鼠的伤口愈合；在另一项研究[32]中，用肥大细胞脱颗粒抑制剂色甘酸二钠预处理可以修复DM 小鼠的伤口愈合损伤。在一项应用光生物调节和条件培养基治疗DM 大鼠伤口的研究中，Bagheri 等[33]发现光生物调节和条件培养基加速了伤口愈合过程，并显著减少了肥大细胞总数和肥大细胞脱颗粒。

单核细胞进入棘层分化为朗格汉斯细胞[34]。DFU 中此类细胞比例显著增加，这与Stojadinovic 等[35]的研究一致；他们还报道了朗格汉斯细胞的数量在DFU 愈合后增 加，表明朗格汉斯细胞对溃疡修复具有理论上的积极作 用。

NK 细胞的主要功能是识别病毒感染细胞表面的主要组织相容性复合物，触发细胞因子释放并引起细胞裂解或凋亡[36]。CD8+T 细胞具有与NK 细胞类似的细胞杀伤功能[37]。本研究发现DFU 中活化的NK 细胞减少，CD8+T细胞的比例增加，反映局部细胞免疫可能参与了DFU 的病理过程，但具体机制有待进一步研究。

既往针对数据集GSE80178 的研究发现了miR-15b-5p 在DFU 中的作用[10]，以及DFS 与nDFS 间的差异[29]。与之不同，本研究旨在探究DFU 发病过程中分子和免疫细胞的变化。从该数据集中本研究共筛选出296 个DEG，用于功能富集和浸润免疫细胞分析，并发现了可能成为DFU 治疗靶点的基因和免疫细胞。DFU 发展中的主要生物过程包括角质化、先天免疫和抗菌功能。此外，高血糖对皮肤局部的免疫细胞比例影响较小，提示溃疡的发生可能与其他因素如神经或血管因素有关。在溃疡发生后，活化的肥大细胞、静息NK 细胞、CD8+T 细胞、单核细胞比例增加，提示它们与溃疡的形成或修复存在关联。考虑到本研究局限于单个数据集，样本数量较少且缺少临床样本验证，未来还需要进一步开展更为深入的实验来验证本研究的结果。

参·考·文·献

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