一株由鸭头分离的巴氏杆菌鉴定与分析

李润楠

（山东省博兴县畜牧兽医服务中心 山东滨州 256500）

鸭巴氏杆菌病（即鸭霍乱或鸭出血性败血症）是目前养鸭业中一种常见的、危害严重的细菌类疾病。该病是一种急性、败血性、高度接触性传染病。其病原菌为禽多杀性巴氏杆菌，该菌可感染多种家禽（如鸡、鸭、鹅等）和野鸟。鸭巴氏杆菌病具有发病急、死亡率高等特点，临床上多表现腹泻等症状，剖检的主要特征为败血症病状，通常表现肝脏颜色变浅，且其表面散布针尖大小灰白色的坏死点，十二指肠出血较为严重，心包积液等病理变化，通常发病率和死亡率均比较高。近年来随着集约化、放牧式养鸭模式的快速发展，鸭巴氏杆菌病发病率呈上升趋势，造成了严重的危害。鸭巴氏杆菌病在我国部分地区发病情况还是比较严重的，对养殖场造成了严重的经济损失，因此必须加强对该病的防控。本文总结了一例由鸭头分离出的禽巴氏杆菌的鉴定，并进行了简要的分析，以供参考。

1 发病情况

山东某养鸭场内50～60 日龄的樱桃谷肉雏鸭突然发病，大部分病鸭精神萎靡，羽毛松乱，尾翅下垂，腹泻，排带有少量血液的腥臭味稀粪，呈白色或黄绿色；严重病鸭两腿酸软，行动缓慢，或瘫痪在角落，不能走动；食欲废绝，喝水欲增加，口鼻中有酸臭味的液体流出，呼吸困难，大口喘气，频繁摇头，体温升高，多在42～43℃。发病1d后陆续出现死亡，送诊时已死亡100 羽左右。根据临床表现初步诊断可能是禽巴氏杆菌病，但该养殖场前一段时间刚刚控制了一起鸭疫的疫情，因此不能排除鸭疫再次感染，需进一步检测。

2 病理变化

对送检的病死鸭进行剖检，可见呼吸道黏膜充血和出血性炎症，皮下组织、腹膜均有出血点，肠道黏膜有充血或呈现卡他性的炎症，尤以前半段小肠最为严重，肠内容物呈污红色。肝脏肿大，有出血点和灰白色坏死点，呈墨绿色，心脏冠状沟脂肪、心肌及心内膜充血或出血，心包内有橙黄色渗出液，胆囊肿大。无菌采集病死鸭肝脏、鸭头等进行实验室鉴定。

3 细菌分离培养

在生物安全柜内将病死鸭的肝脏、脑等组织分别接种于麦康凯平皿和含4%犊牛血清的TSA 平皿，37℃培养24h 后观察细菌的生长情况。结果麦康凯上均无菌落，在TSA 平皿上均出现圆形、边缘整齐、表面光滑、半透明的菌落，且菌落周围不溶血；分别选取肝脏、鸭头分离菌单菌落接种到含4%犊牛血清的TSA 平皿上进行纯化培养，然后经革兰氏染色后，在显微镜下观察菌体的大小、形态及结构。结果肝脏和鸭头中分离菌均为革兰氏阴性小杆菌，单个或成对出现，呈卵圆形。

4 PCR 鉴定

用禽多杀性巴氏杆菌和鸭疫李默氏杆菌特异性基因引物进行PCR 鉴定。挑取单个疑似菌落于100μL 无菌的ddH2O 中，沸水中煮沸10min，10,000rpm 离心5min，取上清液作为PCR 模板。PCR 体系为：2× Taq PCR Master Mix 10μL、上下游引物各0.5μL、模板1μL，补灭菌水至20μL，同时设立阴阳性对照，阳性对照分别选用巴氏杆菌和鸭疫李默氏杆菌标准株，反应条件为95℃预变性5min，95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30个循环，最后72℃延伸10min。反应产物用1%琼脂糖凝胶板电泳后，凝胶板在凝胶成像仪成像分析，结果反应条带的大小与巴氏杆菌预期大小相符，鸭疫李默氏杆菌引物PCR 无条带。由此可以确定该养鸭场只是多杀性巴氏杆菌病，并从鸭头中也分出了多杀性巴氏杆菌病原体。

5 荚膜抗原血清型鉴定

为进一步确定分离株血清型，用多杀性巴氏杆菌分型引物进行PCR 扩增。PCR 体系为：2× Taq PCR Master Mix 10μL、引物各0.5μL、模板1μL，补灭菌水至20μL，反应条件为95℃预变性5min，95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸45s，共30 个循环，最后72℃延伸10min。将PCR 产物经电泳后在凝胶成像仪上出现1,000bp 左右的条带，与A 型扩增目的片段大小一致，因此确定该分离株是荚膜血清A 型的多杀性巴氏杆菌。

6 药敏试验

选择头孢曲松、新霉素、大观霉素、环丙沙星、磺胺甲基异恶唑、阿奇霉素、氨苄西林、恩诺沙星、多西环素、丁胺卡那、氟苯尼考、庆大霉素、红霉素、头孢噻肟、克林霉素、阿莫西林和多粘菌素B 共17 种药敏片进行常规药物耐药性分析。将分离的多杀性巴氏杆菌均匀接种到两个含4%新生牛血清的TSA 培养基上，再将各药敏片均匀放到平板的合适位置，放置37℃恒温培养箱中培养18h 后，观察并测量各药敏纸片的抑菌圈直径，进而对药物敏感性进行判定。结果显示该分离菌对丁胺卡那、头孢噻肟呈现中度敏感，对磺胺甲基异恶唑和多粘菌素B 低敏，其余药物均耐药。以上鉴定和药敏结果已反馈给相关养殖场，该场通过敏感药物治疗5d 后，病情逐渐好转，得到了有效控制。

7 讨论

经过对该养殖场内鸭发病情况调查，发现场内鸭舍、运动场地等活动空间狭窄，场内设施相对简陋，饲养管理水平较差，不久前刚刚发生一起鸭传染性浆膜炎病情。此次疫情为急性发病，短期内死亡较多，多数病鸭精神萎靡、呆立、行走无力、食欲废绝，体温上升，口鼻中流出酸臭味液体，呼吸困难，有的不断甩头等症状。结合饲养条件、卫生管理、发病情况、临床症状及病理变化等综合分析初步诊断为巴氏杆菌感染，但不排除联合感染鸭传染性浆膜炎。通过实验室细菌分离培养，并结合特异性的PCR 检测，最终确定该养鸭场感染A 型多杀性巴氏杆菌病。按照多杀性巴氏杆菌荚膜抗原的不同，被分为A、B、D、E 和F 型5 种血清型，且不同血清型之间缺乏交叉免疫保护。对病原菌鉴定时，有必要明确分离菌的血清型，可为分子流行病学调查和疫苗候选菌株的选择提供科学参考。当前我国禽源多杀性巴氏杆菌的荚膜血清型以A 型为主。本次分离除肝脏组织分出了多杀性巴氏杆菌病原外，在鸭头中也分出了多杀性巴氏杆菌病原。

鸭巴氏杆菌感染是当前养鸭业中最常见的一种传染病，雏鸭高度易感，且5 周龄以下的雏鸭死亡率较高。该病病原为条件性致病菌，在恶劣的环境条件或出现并发病时，鸭群发病率升高，死亡率增大。近几年，禽巴氏杆菌病一般呈地方性流行或者散发，常与其他疾病混合性感染。在实际养殖中禽巴氏杆菌疾病的防控，不能单纯的依靠应用抗生素药物，还应提高养殖场兽医卫生防疫制度的科学执行力。同时要加强日常饲养管理，搞好养殖环境卫生、定期消毒，尤其要消灭老鼠、禁止猫狗等动物与禽群的接触，从源头上切断传染源，是控制该病发生、扩散蔓延的重要防治手段。本研究选择了临床上应用的17 种抗生素对分离的鸭巴氏杆菌进行了药物敏感试验，试验结果表明，该鸭场的禽巴氏杆菌除对丁胺卡那、头孢噻肟、磺胺甲基异恶唑和多粘菌素B 四种药物呈现出不同程度的敏感外，对其他的13 种抗生素均表现耐药性，尤其对临床常用药物磺胺甲基异恶唑等表现出了高度耐药性，这说明该养殖场的药物耐药情况非常严重，这与其日常养殖过程中抗生素的滥用有很大关系。耐药性的严重为临床上治疗鸭巴氏杆菌病及其他细菌性疾病带来很大困难，因此在实际养殖工作中一定要合理用药，减少抗生素耐药性的产生。

鸭巴氏杆菌病临床上常呈现急性败血症过程，急性型发病率和死亡率可高达90%，该病呈世界性分布，是严重危害养禽业的重要细菌性传染病之一，给我国的禽类养殖市场带来了巨大的损失和隐患。目前合理开展全价细菌灭活疫苗的免疫接种能够有较好的保护效果。同时利用流行菌株制备自家灭活苗也可以起到很好的预防效果。