自噬在氟牙症大鼠成釉细胞中的保护作用

翁清清，易芳羽，郁 莹，葛苏钰，张 颖

氟牙症(dental fluorosis)是慢性氟中毒在人体内最早出现的临床表征[1]，主要表现为釉质的白垩斑、着色、缺损样改变及严重的磨损等，影响了许多患者的身心健康。2015年第四次全国口腔健康流行病学调查报告显示全国12岁年龄组氟牙症患病率为13.4%[2]，较十年前11.7%的患病率有所上升[3]。截至2017年，全国氟牙症患病人数2 700万余人[4]。氟牙症病因明确，但具体的致病机制尚不明确。前期有研究发现，体外培养的成釉细胞在过量氟刺激下存在自噬(autophagy)，能在一定程度保护细胞免受凋亡，且具有剂量依赖性[5-6]，但缺乏体内验证的研究报道。因此，本研究利用Wistar大鼠饮用不同浓度含氟水建立氟牙症大鼠模型，通过腹腔注射自噬抑制剂3-MA干预大鼠自噬水平，通过检测大鼠切牙成釉细胞中自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p62蛋白的表达改变和细胞凋亡水平，探索自噬在氟牙症大鼠切牙成釉细胞凋亡中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 4周龄Wistar大鼠48只，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供(实验动物生产许可证：北京SYXK(京)2016-0011)。

1.1.2 主要试剂设备 Beclin1多克隆抗体(ab207612，Abcam)，LC3B多克隆抗体(ab48394，Abcam)，p62多克隆抗体(ab56416，Abcam)，Cleaved Caspase-3 多克隆抗体(9661，CST)，3-MA(S2767，Selleck)；石蜡切片机(LEICA RM2016，德国)，石蜡包埋机(KD-BM，中国)。

1.1.3 动物模型建立 大鼠在上海实验动物研究中心无特定病原体(SPF)级动物房饲养(实验动物使用许可证：SYXK(沪)2019-0003)，适应环境1周后，采用随机数字法将大鼠随机分为6组，每组8只，雌雄各半。A组：饮用常规饮用水，腹腔注射1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)；B组：饮用氟离子浓度为75 mg/L的饮用水，腹腔注射1 mL PBS；C组：饮用氟离子浓度为150 mg/L的饮用水，腹腔注射1 mL PBS；D组：饮用常规饮用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；E组：饮用氟浓度为75 mg/L的饮用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；F组：饮用氟浓度为150 mg/L的饮用水，腹腔注射10 mg/kg 3-MA；腹腔注射给药每隔2 d于上午9点进行。各组大鼠自由饮水饮食，共饲养8周。

1.2 方法

1.2.1 样本采集 大鼠饲养8周后二氧化碳窒息处死，切牙拍照后取双侧下颌骨置于4% 多聚甲醛中固定24 h，随后用10% 乙二胺四乙酸二钠(EDTA)脱钙，6周后石蜡包埋切片备用。

1.2.2 大鼠切牙HE染色 常规HE染色观察各模型组大鼠切牙成釉细胞形态改变。

1.2.3 免疫组织化学染色 大鼠下颌骨切片脱蜡复水，抗原修复，PBS浸泡10 min，3% H2O2溶液浸泡10 min，0.25% Triton X-100破膜15 min；10%山羊血清封闭30 min，一抗按说明书比例稀释后4 ℃湿盒孵育12 h，室温复温1 h，PBS冲洗2 min × 3次；二抗室温孵育1 h，PBS冲洗2 min × 3次；二氨基联苯胺(DAB)显色液室温孵育，显微镜下控制显色时间，待显色合适，PBS冲洗2 min × 3次；苏木精染液复染细胞核，分化液分化，脱水封片，于正置荧光显微镜下观察并采集图像。

1.3 统计学分析

在高倍镜下，每张免疫组化切片随机选取3个视野，免疫组化阳性值定量用Image J软件分析，得到的数据使用采用SPSS 22.0软件包进行双因素方差分析检验，P<0.05为具有统计学差异。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况

各组大鼠生长状态良好，行为活泼，毛色正常，体质量增长趋势基本一致。随着饮水中氟离子浓度增高，大鼠切牙氟牙症表现明显，表现为釉面横纹、白垩色样改变，高氟饮水大鼠切牙出现明显磨损。同时，相同饮水条件下，腹腔注射3-MA的大鼠下切牙切端磨损明显(图1)。

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA图1 大鼠切牙形态颜色的改变Fig.1 Changes of morphology and color of rat incisors

2.2 大鼠成釉细胞形态改变

大鼠切牙成釉细胞呈单层柱状排列，细胞核远离基膜，随着釉质成熟，成釉细胞高度逐渐降低，宽度变窄。饮水中氟离子浓度增高，部分细胞核靠近基膜，成釉细胞下方乳头层细胞由正常的乳头状变为条索状。饮用同一浓度含氟饮用水时，腹腔注射3-MA组的大鼠成釉细胞排列紊乱，原有高柱状结构变矮(图2)。

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA；Bar:250 μm图2 HE染色显示大鼠切牙成釉细胞形态结构改变( ×200)Fig.2 HE staining revealed morphological changes of rat incisor ameloblasts ( ×200)

2.3 大鼠成釉细胞中自噬相关蛋白表达水平

免疫组化检测各组大鼠下颌骨石蜡切片中自噬相关蛋白Beclin1、自噬底物蛋白p62、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3，LC3)的定位和表达的改变，阳性染色为细胞质呈棕黄色。结果显示饮用75 mg/L含氟水的大鼠成釉细胞中Beclin1表达增加(P<0.05)，LC3和p62变化不明显。相较之下，饮用150 mg/L含氟水的大鼠成釉细胞与正常组对比，Beclin1、LC3和p62蛋白水平变化均有显著统计学差异(P<0.05)。此外，在相同饮水条件下，腹腔注射3-MA组的大鼠成釉细胞中LC3和Beclin1蛋白表达量降低，而p62蛋白表达量升高，差异具有显著统计学意义(P<0.05)(图3～6)。

与饮用正常水比较，*：P<0.05；饮用相同水情况下，与腹腔注射PBS比较，#：P<0.05A：Beclin1；B：LC3；C：p62；D：Cleaved Caspase-3图3 大鼠下切牙成釉细胞中蛋白表达的定量结果Fig.3 Quantitative results of protein expression in rat lower incisor ameloblasets

A：0 mg/L；B：75 mg/L；C：150 mg/L；D：0 mg/L + 3-MA；E：75 mg/L + 3-MA；F：150 mg/L + 3-MA;Bar:20 μm图7 大鼠下切牙成釉细胞Cleaved Caspase-3蛋白表达水平(IHC ×400)Fig.7 Immunohistochemical staining of Cleaved Caspase-3 in rat lower incisor ameloblasts(IHC ×400)

2.4 大鼠成釉细胞活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)表达水平

免疫组化结果显示Cleaved Caspase-3在各组大鼠成釉细胞细胞质中均有表达，在饮用150 mg/L含氟水的大鼠成釉细胞中表达明显增高，同时，腹腔注射3-MA使成釉细胞中Cleaved Caspase-3表达增高，差异具有统计学意义(P<0.05)(图3D，图7)。

3 讨 论

氟牙症是在牙齿釉质形成期，长期接受过量氟，使成釉细胞受到损害，造成釉质发育不良[1]，氟牙症的致病机制一直以来受广大研究者重视[7]。成釉细胞是上皮来源的唯一能产生硬组织的细胞，负责调控釉质基质的合成、分泌、重吸收和降解，是釉质形成的关键[8]。大鼠切牙唇侧可持续观察到不同时期的成釉细胞，因此本研究采用4周龄Wistar大鼠，分别通过饮水加75 mg/L和150 mg/L氟离子，喂养8周后，观察到大部分大鼠出现了明显的氟牙症样改变，提示成功复制氟牙症大鼠模型。

自噬是细胞内质量控制系统的重要组成部分，外界刺激造成的细胞器损伤将启动自噬途径进行清除、降解和回收利用，对维持细胞内环境稳定具有重要意义[9-10]。自噬相关蛋白Beclin1、LC3和p62是自噬的常用标志物[11]，Beclin1和LC3参与了自噬体的形成，表达水平与自噬作用强度相一致。而p62作为溶酶体标志物，参与自噬降解过程，其表达水平与自噬作用强度相反。Caspase-3是参与细胞凋亡过程的重要蛋白，被上游凋亡级联反应激活为Cleaved Caspase-3后执行细胞程序性凋亡[12]，因而Cleaved Caspase-3的表达水平可以反映Caspase-3的活性和细胞凋亡情况[13]。

本研究结果显示，当饮水中氟离子添加量为75 mg/L时，大鼠切牙出现釉面横纹，靠近切牙切端的成熟期成釉器组织结构出现紊乱，乳头层呈条索状。此时，成釉细胞自噬水平稍有增高，细胞凋亡不明显。继续加大饮水中氟离子剂量(150 mg/L)时，大鼠切牙出现明显磨损，较多成釉细胞细胞核偏向基膜。成釉细胞中Beclin1、LC3和Cleaved Caspase-3表达增加，p62表达降低，差异具有统计学意义，提示细胞自噬水平和凋亡水平明显增高。研究显示，随着饮水中氟离子浓度增高，大鼠成釉细胞自噬水平逐渐增高[5]，引起成釉细胞损伤呈剂量依赖性[14]，与本研究结果一致。自噬和凋亡是重要的细胞内物质周转机制，两者之间的相互作用关系可总结为[15]：①自噬与凋亡相互独立；②自噬抑制凋亡保护细胞；③在低剂量刺激下自噬抵抗凋亡保护细胞，过量的刺激下凋亡诱导自噬转变为细胞毒性机制。到目前为止，尚不能判断氟刺激下大鼠成釉细胞中自噬和凋亡的关系。

在氟牙症相关的研究中，仅有少量文献报道自噬在过量氟刺激下成釉细胞中的表达水平及作用[5-6,14,16]。为了研究自噬和凋亡之间的作用关系，本研究采用腹腔注射3-MA的方法，在氟牙症动物模型上抑制自噬，探索抑制自噬对成釉细胞凋亡的影响。3-MA是一种选择性PI3K抑制剂，作用于Vps34和PI3Kγ，可以阻断自噬体形成，是一种常用的自噬抑制剂[11]。3-MA给药频率、剂量和方式与实验设计相关，目前尚无统一的给药标准。本研究结合文献[17-19]，选用每隔2 d腹腔注射10 mg/kg 3-MA的方式，持续给药8周。结果显示，3-MA作用后大鼠成釉细胞中表达Beclin1和LC3降低，p62表达增高，提示3-MA抑制了大鼠成釉细胞自噬水平。与此同时，自噬抑制使成釉细胞中Cleaved Caspase-3表达明显增高，细胞凋亡增加，与文献结果一致[16]，提示自噬在一定程度上可以抑制凋亡保护成釉细胞。近来，自噬功能障碍加重氟化物引起的细胞毒性作用也得到了证实[20-21]。

2014年，Suzuki的研究第一次从细胞应激的角度初步探讨了氟作用下成釉细胞自噬途径的存在，提出了氟化物刺激沉默信息调节因子2相关酶1(SIRT1)并启动自噬以保护细胞免受氟化物暴露的伤害[5]。另有研究发现，过量氟引起大鼠成釉细胞发生内质网应激[22-23]，进而使细胞中产生大量错误折叠的蛋白及一些受损的细胞器[24]。这些异常大分子和受损细胞器可以通过自噬途径进行清除，进而维持细胞内环境稳态，避免细胞损伤或死亡。然而，自噬在口腔疾病中通常具有双刃剑的作用[25]，任何过度的自噬活动会对细胞造成一定程度的损伤，甚至引起细胞凋亡和死亡[26]。本研究证实自噬可以抵抗凋亡从而保护细胞，但尚不能明确过量的氟刺激下是否诱导自噬转变为细胞毒性机制。

综上，氟牙症大鼠成釉细胞中存在自噬，且高浓度氟刺激对自噬的诱导作用加强。自噬通过某种途径抵抗细胞凋亡，在一定程度上保护成釉细胞免受损伤。本研究为探索氟牙症的发病机制和对氟牙症的预防及干预提出了一种新的思路，对于氟化物刺激下成釉细胞自噬和凋亡之间的关系，以及自噬具体通过什么途径减少大鼠成釉细胞凋亡仍需进一步研究。