产油微藻的筛选、培养及在污水处理中的研究进展*

陶海涛 虎雨 伍家字 刘同辉 李雅婕,2

(1.苏州科技大学环境科学与工程学院 江苏苏州 215009；2.江苏省厌氧生物技术重点实验室 江苏无锡 214122)

0 引言

我国是第二大化石能源使用国，化石能源的急剧减少制约了国家的经济增长，生物柴油作为最有潜力的替代能源开始进入人们的视野。生物柴油从早期发展至今，产油原料发生了由第一代农作物过渡到微藻的变化，以微藻作为生物产油原料这一想法早在1960年就由两位美国学者提出，在此之后，各国在微藻研究方面取得了显著成果。20世纪70年代末，美国能源部从大量微藻中挑选出300株油脂含量高的能源微藻；21世纪初期，英国建成了产量达25万t/a的大型生物柴油厂[1]；中国近些年在微藻生物燃料方面同样发展快速。缪晓玲等[2]通过异养转化细胞得到了油脂生产率是自养藻细胞产油率3.4倍的高脂肪异养小球藻细胞。海南绿地微藻生物科技公司用二氧化碳气体养殖产油微藻，其含油量高达30%[3]。尽管全球都十分重视产油微藻在生物柴油方面的发展，但目前还没有实现生物柴油的产业化，主要因为微藻在培养过程中，成本占到总成本的一半以上，效率低且油脂回收率低，在实际的污水培养中生长能力弱。因此，本文旨在从产油微藻中分离筛选出油脂含量高、生长状况稳定和抗逆性强的微藻进行培养，微藻的低成本高效培养可以通过污水来实现，藻类吸收污水中过剩的氮磷等元素用于生长，同时使废水也得到了净化。在此基础上，为之后微藻的规模化培养和实现生物燃料的产业化发展提供参考。

1 产油微藻的筛选

微藻作为产油原料的优势很多，具体如下：

(1)产油率高。单位面积产油微藻产油率大约是农作物产油率的十倍左右。

(2)净化污水和减缓温室效应。产油微藻在污水处理的二级出水中可吸收水中过量的氮磷等元素作为自身的生长因子，还可吸收温室气体。

(3)适应能力强。生长环境简单，分别在含盐性、碱性的土壤中进行规模化养殖。

(4)价值极高。可制备生物柴油，同时可开发高价值产品并投注于生产。

具备以上特质并且能够用于生物制油原料的微藻种类很多，但不同种类产油微藻的油脂含量有所差异。王立柱等[4]从云南滇池的水样中多次分离纯化得到6株微藻，将其接种于无氮SE培养基，调节氮元素质量浓度为41 mg/L，置于光照强度为4 000 lux、150 r/min、25 ℃的摇床中培养28 d后发现5号藻的油脂产率最高，达到28.6 mg/(L·d)，经鉴定该藻属小球藻属，将其命名为小球藻(Chlorellavulgaris,C.vulgaris)。由此可见，产油微藻的筛选对微藻产油的作用十分重要。因此，实现产油微藻规模化发展并且能够与石油企业相抗衡的首要步骤就是优势微藻的获取。

在对产油微藻的筛选过程中，主要以下3点作为筛选的指标：

(1)生物量，单位体积内所含藻细胞的数量或单位时间内一定体积的藻液生物质的增长量。

(2)油脂生产率，单位时间内和单位体积内油脂的积累量。

(3)微藻的耐受性、稳定性和不可逆性，在培养过程中，温度、pH值和营养成分的变化对藻类的生长和油脂的积累影响极小甚至无大影响。

在大多数能源微藻的分离筛选过程中，油脂生产率是筛选的首要因素，其次是微藻的生长情况，胡文军[5]从江南大学校园内外的几条污水沟和无锡太湖流域中多次采样，分离得到14种微藻，从中挑选12种进行自养培养，实验发现，在这12种微藻中，藻种Y06的生物量最大，为1.73 g/L，虽然油脂含量不是最高，但也仅位于第二，因此该实验取最有产油潜力的Y06进行培养条件的优化。

综合上述分析，产油微藻要实现产业化，就不得不对大量微藻进行分离筛选，不仅需要参考微藻一定时间内单位体积的藻细胞增长情况，还要对比微藻的油脂产生速率，如果选出一种藻用于污水的处理，这时微藻的耐污性和稳定性也十分重要。

2 产油微藻培养技术

目前，人工规模化培养产油微藻，主要为光能自养和异养两种方法。光能自养大多采用开放式跑道池和封闭式光反应器进行培养，而异养培养多在发酵罐中进行[6]。笔者对上述的培养方式进行总结，不同方式的优缺点见表1所示。

表1 光能自养培养和异养培养的优缺点

往往使用培养基(如BG11，D1和海水培养基等)进行培养产油微藻藻种，但这些不一定是产油微藻藻种的最优培养基。因此，可通过改变培养基成分，调节光强、温度和pH值，进一步优化产油微藻的培养条件，提高产油微藻藻种的油脂生产率。

温度主要影响产油微藻的生长速度、油脂含量和脂肪酸组分。不同微藻对温度有不同的适应范围，具有专一性。研究发现，培养温度从25 ℃提高到30 ℃，Chlorellavulgaris的油脂含量从14.71%降到5.90%；培养温度从20 ℃提高到25 ℃，Nannochloropsisoculata的油脂含量增至2倍。温度变化还影响微藻脂肪酸组分中不饱和脂肪酸(PUFAs)含量，PUFAs含量低的生物柴油质量优良且稳定性高[7]。因此，在筛选藻种时应首选温度适应范围广的藻种，同时在大型生产时应注意保持微藻的培养温度。

微藻的生长环境也有最适合的pH值范围。在培养微藻的过程中，随着培养基中物质不断变化，pH值随之改变。为了使微藻能够长期处于快速增长状态，必须维持培养基的pH值相对稳定。

影响生物生长的重要因素还有营养物质和光强。强光照会对产油藻类的光合系统造成不可逆的损伤，影响其生长。研究发现，在户外光照条件下球等鞭金藻(Isoch-rysisgalbana)的代时要比在实验室条件下短[8]。由此可见，微藻在耐受光强的范围内，光合作用随光强增加而增强。光强影响微藻自身的化学组成结构，在不同的光照条件下，藻细胞的光合活性及总化学成分色素会发生显著变化。产油微藻还需要各种无机营养元素，氮元素是构成核酸、氨基酸、蛋白质等有机物的组成元素。培养液中氮元素含量影响产油微藻的油脂含量和生长速率。黄建忠等[9]发现尿素和硝酸铵对细胞的生长有利，但是会抑制油脂含量增加。当氮元素匮乏时，会加速藻细胞的油脂含量，例如LIANG Y等[10]对小球藻进行氮抑制处理后藻细胞脂质含量增加了5%。另外，磷元素是合成核酸、酶、NADPH、ATP等的重要组分，对产油微藻的生长有重要影响，磷元素缺乏会导致生长减缓。因此，在产油微藻大规模生产之前，首先确定该藻生长的最佳光照强度并且了解其对氮磷等无机营养元素的需要范围，防止藻类在培养过程出现不增长反而减产的现象。

3 产油微藻回收技术

微藻个体小，细胞表面带负电荷，因此微藻可以稳定悬浮在培养液中，而且产油微藻实际藻液生物质含量低，通过自养方式，在反应器中所获得藻体生物量范围约0.14～4.0 g/L[11]，这使得产油微藻回收困难，采收成本占20%，面对这一实际情况，高效回收产油微藻油脂是实现生物柴油产业化的一个重要突破点。微藻的回收技术分为两个步骤:预处理和富集分离。

3.1 预处理

藻液体预处理是向藻液中添加氧化剂或化学药品以及利用物理手段使藻的生物质絮凝的过程，其本质是改变微藻的化学环境或物理性质[12]。常用的方法如下：

(1)预氧化。藻类预氧化通过添加氧化剂到藻液中，以此促进藻液富集分离。它能帮助藻类生物质在氧化剂适量时凝聚，但高剂量作用下会伤害微藻细胞，严重可导致藻类死亡。根据氧化剂分类，预氧化可分为臭氧氧化、预氯化和高锰/高铁酸盐预氧化。

(2)化学絮凝。化学絮凝分为金属盐絮凝和高分子聚合物絮凝，这两类絮凝作用都是通过吸附电中和、吸附架桥和网捕沉淀作用使藻类细胞絮凝沉淀。前者利用金属盐离子形成多种金属离子的聚合体，再通过吸附架桥形式作用于藻细胞，从而絮凝沉淀；后者张鹏等[13]在采收小球藻上清液时，向其中投加壳聚糖，发现其不仅凝聚效果好还能有效提高絮凝速度。王寿兵等[14]自主研发的新型絮凝剂，该絮凝剂的主要成分为钙、镁和硅离子，呈粉末状，向滇池富藻水投加500 mg/L的絮凝剂，絮体会下沉到容器底部。化学絮凝适用范围小，不适用于大型回收，其高碱性上清液必须通过中和处理才可用于微藻的继续培养，成本较高，除此，藻液中的金属离子和金属聚合物会造成二次污染。

(3)物理絮凝。物理絮凝有电场絮凝和超声波絮凝。电场絮凝通过施加电场，使得培养液中的藻细胞向外加电场中的正极移动，一旦藻细胞到达正极即发生电中和作用，继而产生絮凝行为，从而导致藻类细胞聚集并形成大的絮凝物[6]。而超声波絮凝是在超声波作用下破坏藻细胞的微泡来促进藻类生物质的絮凝和沉淀。利用超声波处理微藻时，藻细胞在超声波作用下相互聚集沉淀，虽然该方法能耗高，但对高浓度的单胞藻(Monodussubterraneus)的絮凝率可达90%[15]。

3.2 富集分离

经预处理后的藻液，可进行富集分离。富集分离主要的方法如下：

(1)沉淀分离法。沉淀法是将微藻生物质从培养液中分离出的最常见的方法之一，其主要针对密度较大易沉降的藻细胞，用于污水处理中，沉淀时间长，花费大且分离效果差。

(2)气浮分离法。气浮分离法的主要步骤是先向藻液中添加絮凝剂来絮凝藻类生物质，然后打开气浮装置释放气泡，这些小气泡在浮动过程中遇到絮凝物质并被吸附，使它们漂浮到液体表面，从而降低了絮凝物的总密度[16]。气浮法在污水处理、食品制造工业等领域得到良好的应用，但在藻液采收方面的报道屈指可数。曾文炉等[17]在探究不同操作条件下对螺旋藻连续气浮采收速率影响的实验中发现，通过添加剂量较大的絮凝剂、调节pH值为12、提高溶气压力等条件可使净化率达到更高的水平，与传统分离法相比，气浮法虽然采收藻液的含水量相同，但耗能仅为离心法的40%～65%，这为其在工程实践中提供了良好的依据。

(3)离心分离法。离心分离法是当下应用最广的方法，几乎所有的微藻回收都在使用，早在1991年，Chisti等就提出利用离心法回收微藻。离心法是通过离心力的作用使细胞沉降从而分离。在合适的条件下，微藻回收效率达95%，但运行成本高，应用范围小，仅适用于价值高的产品开发。

(4)过滤分离法。过滤法是常用的固液分离的方法，通过传质力的作用，将藻液通过滤膜排出，而藻类生物质留在滤膜上。宫庆礼等[18]用超滤处理藻液，单胞藻浓度为24×108个/mL，实验过程中膜的流通量稳定。但由于滤膜孔径小，个体微小的藻类易堵塞滤膜，需要进行冲洗滤膜、换膜等措施，所以该方法成本高，只适用于小型微藻回收工程。

4 产油微藻在污水处理中的应用

针对产油微藻培养成本高的问题，很多学者提出利用污水中的营养物质培养产油微藻，在此基础上微藻通过固定二氧化碳、改变pH值和产生氧气创造出不利于水中残留有机物和微生物的生存条件，以此达到对污水处理净化的作用。微藻还可以吸收污水里的重金属离子和放射性元素，例如金鱼藻对放射性锶有较强的富集作用，此吸附过程成本低，消耗能量少，并且无二次污染物[19]。微藻自身也具备检测和指示作用，各污水带分布着不同种类的藻，用来鉴别污水处理的程度[20]。利用产油微藻处理污水的几种常见应用类型如下。

4.1 高效藻类塘

高效藻类塘(High Rate Algae Pond，HRAP)是在稳定塘的基础上利用塘内藻类和细菌相互作用形成的高效去除水体中氮磷元素的菌藻共生体。藻类的生长繁殖为细菌提供了生长环境并且也能使水中溶解氧维持在较高浓度下，细菌的存在也为藻类的生长提供了充足的氮源和磷源。因此，高效藻类塘对水中的有机污染物、氮磷元素有着高效的去除率。2006年，同济大学建立的一套高效的藻类塘系统，在工程中作业后，COD的检测量不到30%，夏季藻类塘几乎检测不出氨氮[21]。HRAP在实际应用中占地面积少，能承受负荷大的污水。

4.2 固定化藻

固定化技术是在物理和化学上固定藻类于有限的空间，以保持它的活性。固定化技术分为吸附法和嵌入法。吸附适合于纤维状藻类，但在实际应用中只能吸附部分细胞并且细胞容易脱落，局限性大。而嵌入法具有广泛的应用范围，其原理是截留微生物细胞于不溶性的凝胶聚合物的网状结构中，通过聚合、沉淀或改变环境的手段对细胞截留。该方法中，细胞和载体之间没有约束，而且对微生物活性无干扰，并且形成的颗粒具有高强度[22]。王翠红等[23]扩大培养收集到的藻菌共生体系离心浓缩后用藻酸钠包埋固定直径为3 mm的小珠，用固定化小球藻处理酚质量浓度300 mg/L的有机废水，在一定条件下处理1 d后，水中的酚质量浓度可降至0.5 mg/L，达到国家地面水一级排放标准。实验表明，用固定化藻可去除含酚废水中的杂质和异味，而且成本低。

4.3 微藻光生物反应器

光反应器应用于污水处理及藻类资源收获一体化，其原理是将人工培养的高浓度微藻放入该反应器再利用污水进行藻类的持续培养。管式光生物反应器应用范围大[24]，构造简单，其主要由一根玻璃管构成[25]，利用泵提供动力使藻循环运动，充分吸收光能，利用气体交换器补充CO2以及释放O2。吕素娟等[26]用不同的培养液在气泡柱式光反应器中培养栅藻(S.dimorphus)，实验结果表明纯废水的氮磷浓度比标准BG11中的氮磷浓度低得多，完全不足以维持栅藻最佳的生长环境，反而还要向纯废水中添加氮磷。另外，在合适的加入量下培养3～4 d的水体，检测其中的TN和TP残留情况，发现并无氮磷存在。所以用生活污水培养栅藻不仅能增加栅藻中含油的生物质，还去除了水中的无机氮和无机磷，从而实现污水的低成本资源化。

5 结论

(1)产油微藻筛选主要考察生物量，油脂生产率，微藻的耐受性、稳定性和不可逆性等指标，其中油脂生产率是主要筛选因素，其次是微藻的生长情况。

(2)产油微藻的培养有自养和异养两种，培养过程前必须优化培养条件，严格控制温度、pH值、光照强度和培养基中的营养因子。

(3)产油微藻生物质的回收分为预处理和富集分离两个步骤，预处理中絮凝法应用最为广泛，主要因为其操作简单；富集分离中离心分离法在实际的微藻回收生产过程中应用广泛，气浮分离法虽然回收率高但在微藻回收产业化方面应用性不强。

(4)将产油微藻应用于污水处理中主要有光生物反应器、高效藻类塘和固定化藻3种类型。其中光生物反应器结合污水的处理和产油微藻的培养，将污水输进反应器内，藻类吸收污水中过剩的氮磷等元素进行生长，同时使得污水得到充分净化。

6 展望

由于人类经济发展进程的不断加快，化石能源短缺、全球气候变暖等问题愈发严重，开发可持续的绿色新能源成为解决这一系列问题的重要办法。因为产油微藻产油量高、不争地等优点，所以产油微藻是理想的生物制油原料，但微藻生物柴油还存在着很多局限性，例如微藻培养高成本低效率、培养器无法实现规模化、产油率低、微藻回收资金投入过高和利用污水培养产油微藻死亡率增高等问题。针对产油微藻培养成本高的问题，除了目前使用最多的在废水中培养外，将来还能够利用二沉池里的废弃污泥对微藻进行培养，吸收污泥中过量的氨氮，减轻污泥的后续处理；对于产油微藻产油率低下这一问题，未来可将研究方向重点集中在生物工程，利用转基因技术在最短时间内生产大数量而且高产油的微藻，也可通过PCR技术对产油微藻中表现产油量性状的基因进行改造或是对基因的重新排列，最终达到微藻的高产油和高密度；对于产油微藻生物质的回收，可以利用萃取的手段，寻找既在经济上比较便宜又能达到高回收率的萃取剂，与此同时，还应该易降解，减少二次污染，如此可将这类萃取剂大批量应用于大规模的回收过程中。