蓝莓花青素对镉致小鼠心脏损伤的改善作用

龚 频， 高浩天， 杨文娟， 常相娜

(陕西科技大学 食品与生物工程学院， 陕西 西安 710021)

0 引言

重金属镉是环境中主要的有毒元素和人体致癌物质，是生物浓度因子(BCF)大于100的第二大危险金属.世界卫生组织允许饮用水中的镉浓度为0.005 mg/L，但由于这种金属的工业实用性，实际含量远超此标准[1].少量的镉暴露就能产生严重损伤[2]，且镉的生物半衰期长达20～30年，极易通过食物链在人体中长期蓄积[3].动物体内的镉暴露会导致代谢紊乱的可怕症状，引发高血压和心脏毒性[4]，镉毒性是造成人体心肌梗塞、外周动脉疾病、高血压和动脉粥样硬化等各种心血管疾病的独立危险因素[5].

研究表明多种心血管疾病的发生均与脂肪酸代谢的改变有关[6]，脂质代谢异常产生的脂毒性是造成心血管疾病、动脉粥样硬化的原因之一.游离脂肪酸的代谢异常与高血压、冠心病的发生发展及心衰的心肌能量代谢异常有明显的相关性[7].游离脂肪酸作为机体的一种能量物质，其代谢异常可引起脂质代谢紊乱，是代谢综合症发病的一个十分重要的因素[8]，而脂质代谢紊乱又是引起动脉粥样硬化的重要危险因素[9].有多项研究表明镉对心脏具有毒性作用[10]，其毒性机制与镉诱导氧化应激、细胞膜脂质过氧化、脂质过氧化物(lipid peroxides，LPO)增加、心肌细胞凋亡和衰老[2,11]相关.镉暴露还能够导致心脏内皮细胞坏死，进而引起心肌缺血.心肌缺血会使交感肾上腺素能系统的活动增强，血中儿茶酚胺增高，导致蛋白脂酶的活性增加，内生性脂解作用增强，使游离脂肪酸增加，进一步引起“脂毒性”，加剧镉对心脏的损伤作用.

寻找一种能够有效防治镉引起心脏毒性的功效成分迫在眉睫，蓝莓花青素是一种类黄酮的多酚色素，具有抗氧化、抗炎、抗微生物、保护心血管等作用，可调节各种代谢途径来维持体内稳态[12]，定期食用类黄酮可降低死亡率，食用富含蓝莓花青素的食物可调节血脂血压，降低罹患心血管疾病的风险，蓝莓果实富含蓝莓花青素，健康人群连续一个月每日食用200 g蓝莓，能够有效改善血管功能、降低血压，效果可与降压药相媲美[13].欧洲和亚洲已经将服用蓝莓花青素用于治疗动脉粥样硬化[14,15].蓝莓花青素具有较强的自由基清除能力，可清除机体中大量的自由基，可以用作抗氧化剂，抑制低密度脂蛋白和高密度脂蛋白被氧化，从而减轻动脉粥样硬化的发生，发挥保护心血管的作用[16].花青素具有明显的调节脂质代谢和改善动脉粥样硬化的作用，这可能与花青素激活胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)而促进胆固醇的代谢有关[17,18].此外，在内皮细胞中加入花青素可以保护内皮细胞免受氧化应激的损伤[19.20].花青素还能够增加内皮型一氧化氮合酶的表达[21,22].因此蓝莓花青素可作为一种治疗镉致心脏损伤的潜在药物.

本研究基于GC-MS技术结合代谢组学方法研究蓝莓花青素对镉致小鼠心脏组织脂质代谢物的影响，利用XCMS软件对采集得到的总离子流图进行峰识别、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作，将结果转化为化合物的保留时间和峰面积信息.通过SIMCA-P11.0统计软件进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘分析(PLS).利用生物学数据库进行生物标志物的鉴定.通过比较其脂质代谢物水平的差异，探讨蓝莓花青素对镉致小鼠心脏损伤的保护作用，并初步阐释其作用机制.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

动物：雄性昆明小鼠(SPF级)，购于西安交通大学医学实验动物中心，体重(20±2) g，动物生产许可证号 SCXK(陕)2017-003.

药品与试剂：蓝莓花青素，大兴安岭林格贝有机食品有限责任公司；氯化镉，天津市福晨化学制剂厂；十七烷酸，阿法埃莎(天津)化学有限公司；DMP，阿达玛斯试剂有限公司；其他均为分析纯.

仪器：电子天平(型号TDL-40B)，上海精密科学仪器有限公司；GC-MS，美国安捷伦科技公司.

1.2 动物模型的建立及给药

雄性昆明小鼠40只，适应性饲养3 d，自由取食饮水.随机分成空白组、模型组、蓝莓花青素低、中、高剂量组(0.3 mg/kg/d、3 mg/kg/d、30 mg/kg/d)，每组8只.除空白组每天注射，灌胃生理盐水外，其余各组小鼠腹腔注射CdCl2水溶液(2 mg/kg/d)，其中蓝莓花青素低、中、高剂量组灌胃不同剂量蓝莓花青素溶液，连续处理14 d.末次给药后禁食12 h，小鼠断颈处死，迅速取出心脏，于-80 ℃冰箱保存.

1.3 配制内标溶液

称取1 mg十七烷酸酯，用甲醇配制成1 mg/mL的内标储备液，待用.

1.4 样品的前处理

取心脏组织10 mg，加入1 mL DMP与浓HCl的混合溶液(每毫升混合液含20μl浓HCl)，涡旋3～5 min，制备混悬液.再加十七烷酸内标液20μl，通氮气10 s，摇床振荡20 min(25 ℃，150 r/min)，反应产物用氮气吹干.向干燥残渣中加1.5 mL含5%无水HCl的甲醇溶液，80 ℃水浴加热2～4 h，向样品中加等体积去离子水，石油醚萃取，振荡混匀，取石油醚层，加无水Na2SO4干燥，过滤，真空干燥，通氮气10 s，样品冷冻待检测.

1.5 分析条件

色谱条件：载气为氦气，流速为1.5 mL/min，自动进样1μl，不分流.进样口温度为290 ℃，初始柱温60 ℃，维持4 min后，以5 ℃/min升温至150 ℃，再以4 ℃/min升温至300 ℃，维持25 min.

质谱条件：EI离子源，正离子检测，电离能70 eV，离子源温度230 ℃，检测器温度150 ℃，电子倍增器电压1 070 V，溶剂延迟3.75 min，扫描方式为全扫描方式.

1.6 数据采集及分析

采用GC-MS对样本进行检测，得到样品总离子流色谱图，利用XCMS软件对采集得到的谱图进行峰识别、峰对齐、峰匹配和峰强度校正等操作，将结果转化为化合物的保留时间和峰面积信息，将其导入SIMCA-P11.0统计软件进行主成分分析(PCA)，用于观察样本的聚集与离散程度；偏最小二乘法PLS能显示组间差异.PCA结果用散点图来显示，其代表样本的离散程度，离散越接近表示含有相似的代谢组分.PLS用于鉴定组别.根据VIP值筛选差异代谢物，并利用SPSS统计学软件进行t检验，显著性水平设为P<0.05，利用NIST代谢物数据库，二级质谱及标准品对照进行生物标志物的鉴定.

2 结果与讨论

2.1 镉暴露小鼠心脏脂肪酸鉴定

对镉暴露小鼠心脏组织样品进行GC-MS分析，得到总离子流色谱图，结果如图1所示.由图1可以看出，保留时间10 min后开始出峰，15～37 min检测出较多物质.通过与标准品保留时间及质谱图对比，可对色谱峰进行鉴定.

图1 小鼠心脏脂肪酸总离子流图

2.2 组间代谢差异分析

PCA是一种无监督的模式识别分析方法，可在多维空间对样本间差异进行直观显示.图2为小鼠心脏组织PCA得分图.由图2可以看出，通过PCA分析游离脂肪酸(FFA)的自动标定数据，各组组内样品分布密集，差异很小.空白组、模型组、蓝莓花青素保护组的代谢表现有一定的区分，说明心脏代谢产物存在差异.其中，空白组与模型组完全分离，表明CdCl2暴露会损伤小鼠心脏的正常生理功能.

为了更好地对空白组、模型组、蓝莓花青素保护组的心脏组织代谢谱图进行分型，需要借助其他多变量模式识别方法.PLS是一种有监督的模式识别方法，目的是建立类别间的数学模型，使样本间达到最大分离.

图3是小鼠心脏组织的PLS图.由图3可知，从空间位置上来看，模型组与空白组组织标本之间分开趋势良好，相互远离，差异明显，且组内样品相对聚集，差异较小，表明模型组小鼠心脏代谢物与空白组相比发生了明显变化，镉暴露可能对小鼠心脏组织的正常功能产生影响，模型构建成功；再从空间位置上来看，蓝莓花青素各保护组介于空白组和模型组之间，且蓝莓花青素各保护组小鼠心脏样品中的代谢散点趋向空白组，提示蓝莓花青素各剂量对小鼠损伤心脏产生一定程度的保护作用，其中高剂量组距离空白组最近，说明高剂量组的保护效果最明显.

K为空白组；A、B、C为低、中、高剂量组；S为模型组图2 小鼠心脏组织PCA得分图

K为空白组；A、B、C为低、中、高剂量组；S为模型组图3 小鼠心脏组织PLS图

2.3 潜在生物标记物的确定

根据比较模型组与空白组的GC-MS结果，获得几种变化显著的脂肪酸，这些变化显著的脂肪酸可能作为镉诱导心脏损伤的潜在生物标志物.这些物质的分子量可以通过图4的质谱图确定，通过NIST08软件对可能的结构式进行模拟计算，在NIST代谢物数据库中进行检索，结合质谱数据分析和标准品对照，确定图4中物质的种类.

结果显示，脂肪酸生物标记物为图4(a)棕榈酸、图4(b)硬脂酸、图4(c)亚油酸、图4(d)花生四烯酸、图4(e)二十碳五烯酸和图4(f)二十二碳六烯酸.

(a)C16∶0 棕榈酸

(b)C18∶0 硬脂酸

(c)C18∶2 亚油酸

(e)C20∶5 二十碳五烯酸

(f)C22∶6 二十二碳六烯酸图4 潜在生物标记物的质谱图

通过检索代谢物数据库，并通过二级质谱和标准品对照确定了变化显著的6种脂肪酸，其结果如表1所示.由表1可知，与空白组相比，模型组小鼠心脏组织中亚油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸含量减少(P<0.05)，其中二十二碳六烯酸含量下降最多，含量仅为空白组的62%，亚油酸减少了29%，二十碳五烯酸减少了24%；而棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸含量增加(P<0.05)，其中硬脂酸含量增加最多，含量为空白组的3.19倍，而棕榈酸增加了2.03倍，花生四烯酸增加了1.85倍.说明镉的摄入已经严重影响到了小鼠正常的生理功能，引起了小鼠心脏组织严重的代谢紊乱，造成了可怕的脂毒性.已有研究表明，棕榈酸可诱导心肌细胞凋亡，其在人体内含量升高会加剧罹患冠心病的风险[23,24]；硬脂酸能引起低密度脂蛋白含量升高并导致冠心病[25,26]；花生四烯酸在介导炎症反应同时引发动脉粥样硬化[27,28].镉毒性暴露能够显著增加这三种脂肪酸的含量，表明镉通过紊乱脂质代谢，从而增加了机体心脏的损伤；此外，亚油酸具有降血脂作用[29]；二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸对线粒体的合成、抗氧化酶表达和氧消耗效率有益[30].这些有益的不饱和脂肪酸的减少，也验证了镉毒性暴露通过干扰正常的脂质代谢水平，导致心脏损伤增加.

在给予蓝莓花青素后，蓝莓花青素能够显著地改善脂质代谢紊乱的状况，其中，下调机体心脏组织中棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸含量，分别减少为模型组的75%、64%和91%，同时，对有益的不饱和脂肪酸含量也起到了调节作用，增加了亚油酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸含量，分别增加了1.73、1.29和1.67倍，该结果说明蓝莓花青素增加了心脏组织中有益不饱和脂肪酸的比例并减少了饱和脂肪酸的量.进一步说明蓝莓花青素通过改善脂质代谢紊乱、调节心脏组织中镉毒性造成的脂毒性，从而发挥心血管保护作用.Crespo等[31]指出蓝莓具有抑制心脏代谢紊乱的潜力，摄入花青素可以降低心血管疾病和高血压的风险.Wu等[32]发现喂食蓝莓汁可以减少高脂饮食下小鼠体内的脂肪蓄积.Graf等[33]给予大鼠富含花青素的葡萄越橘汁，发现灌胃后大鼠血浆中的不饱和脂肪酸含量增加，同时饱和脂肪酸含量减少，蓝莓花青素能够调节机体的脂质代谢，这与本实验的结果一致.

表1 心脏组织潜在脂肪酸生物标记物

3 结论

本研究通过建立镉致小鼠心脏损伤模型，基于GC-MS技术分析发现镉暴露后小鼠心脏组织脂肪酸代谢异常，并确定了6种潜在生物标记物，棕榈酸、硬脂酸、花生四烯酸、亚油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸.在经蓝莓花青素处理后小鼠心脏各项脂肪酸指标均趋向于正常组别，蓝莓花青素通过改善了脂质代谢紊乱，对镉致心脏损伤起到一定的保护作用.此外，由于镉毒性能够引起脂肪酸的异常变化，因此，某些特殊的脂肪酸可作为镉毒性的特征生物标志物，用于镉中毒的预防及防治.