鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离影响研究

夏尧干，王 宇，邹雯燕，钱婷婷，古东颖，梁明在*

(1.淮阴工学院 化学工程学院制药工程系，江苏 淮安 223003；2.台湾义守大学 化学工程系，台湾 高雄 84001)

鱼油是一种从深海多脂鱼类中提取的油脂，富含多种对人体有益的多不饱和脂肪酸[1]。鱼油是指包括鱼肝油在内的鱼的脂肪，但是它的主要功效成分有两种，分别为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，目前市场上出现的鱼油产品也多以鱼油脂肪酸EPA和DHA为主。作为一种新型保健医疗食品，鱼油脂肪酸EPA和DHA具有调节血脂、改善视力、预防老年痴呆和脑血栓等多种功效[2]。但是未经过加工处理的粗鱼油中EPA和DHA的含量相对较低，不能直接满足保健食品及医药行业的要求。除此以外，粗鱼油中的饱和脂肪酸及胆固醇等物质也会在一定程度上增加服用者患病的风险，所以需要对粗鱼油中的鱼油脂肪酸EPA和DHA进行富集和纯化处理[3]。虽然鱼油脂肪酸EPA和DHA都是鱼油的主要功效成分，但是二者的生理作用却存在着一些差异[4]，所以在某些情况下需要根据不同用途将二者进行分开使用。为了便于实现二者功效最大化，需要制备高纯度的鱼油脂肪酸EPA和DHA单体。现代企业制备高纯度鱼油脂肪酸EPA和DHA单体主要分为两个步骤，第一步是对粗鱼油中鱼油脂肪酸EPA和DHA进行富集处理，第二步是对富集得到的鱼油脂肪酸EPA和DHA混合物进行分离纯化，最终获得高纯度的鱼油脂肪酸EPA和DHA单体[5]。在目前的鱼油生产过程中，大部分的企业采用低温结晶法、尿素包合法、分子蒸馏法等方法来实现鱼油脂肪酸EPA和DHA的富集[6]，但这些方法或多或少存在着一些缺点，比如富集效率低、能耗大、溶剂用量大、溶剂残留等，这些缺点都会对后期高纯度鱼油脂肪酸EPA和DHA单体的制备产生一些不好的影响。超临界流体色谱技术(SFC)作为一种新型的提取分离技术，不仅具有超临界流体萃取操作温度低、参数调节方便、后处理简单、无溶剂残留等众多优点，而且还兼备了色谱法高效性和高选择性的特性，现已被广泛应用于天然产物的分离制备[7]。例如任其龙等[8]结合之前的研究，以超临界 CO2作为流动相、富含苯环的反相填料作为固定相，发明了一种超临界色谱制备高纯度鱼油脂肪酸EPA和DHA单体的工艺。该工艺将鱼油原料液直接注入色谱柱中进行分离，最后采用馏分切割装置制备出纯度大于95%的鱼油脂肪酸EPA和DHA单体。Zhao等[9]采用超临界流体色谱技术有效分离了胡芦巴中的6对螺甾皂苷25R/S异构体，并对其进行了分析研究。吕惠生等[10]采用超临界流体色谱技术直接从柠檬酸发酵液中分离制备得到纯度高达99.6%的柠檬酸。本研究以鱼油脂肪酸EPA、DHA标准品为研究对象，采用超临界流体色谱技术探究温度、压力以及辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离影响，为后续分离纯化出高纯度的鱼油脂肪酸EPA和DHA单体提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1仪器

超临界设备(台湾金属工业研究发展中心)；高效液相色谱仪(泵HITACHIL2130)；检测器(HITACHI L-4200 UV-Vis)；SAMPO KB-RD85U型真空烘箱。

1.1.2试剂

鱼油脂肪酸EPA及DHA标准品(南京春秋公司)；95%乙醇(景明化工股份有限公司，分析纯)；CO2(锦德气体有限公司，纯度>99.9%)。

1.2 方法

1.2.1分析方法的建立

为了比较不同条件下鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离效果，本实验确定以分离常数K作为评价标准的分析方法。分离常数K的计算如下：

式中t0为不滞留成分的流出时间，tR为鱼油脂肪酸EPA和DHA滞留时间与死时间td的差值，Ei表示管柱的孔隙率。

实验选用的管柱为Viridis silica 2-EP(250 mm × 10 mm，5 μm)，辅溶剂为99.5%的乙醇，CO2的流速为4 g/min。选取实验条件温度(30, 40, 50℃)，压力(120, 140, 150 bar)，辅溶剂比例(8%、10%、12%)进行分离效果影响实验。分析实验结果并通过二者分离常数的差值△K来评价鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离效果。

1.2.2色谱条件

超临界流体色谱分析条件：流动相为二氧化碳-乙醇；紫外检测波长为 215 nm；进样量为20 μL；CO2的流速为4 g/min。

2 结果与分析

2.1 温度的影响

作为一种超临界流体，CO2的溶解能力以及扩散系数在很大程度上受到柱温度变化的影响。一般情况下，色谱柱的温度越大，超临界CO2流体对溶质的溶解能力越好，同时其粘滞系数也会有所降低[11]。该因素的实验分析以在120 bar、10% ETOH条件下得到的结果为例，由表1可知，当色谱柱的柱温度逐渐升高时，鱼油脂肪酸EPA和DHA的滞留时间也逐渐变长。与此同时，随着色谱柱温度的升高，鱼油脂肪酸EPA和DHA之间分离常数的差值△K也逐渐增大，因此适当提高温度有利于鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离。分析实验结果可知，当色谱柱温度达到50℃时，鱼油脂肪酸EPA与DHA分离常数的差值△K最大，分离效果最好。

表1 温度对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离效果的影响

2.2 压力的影响

通过分析实验结果，发现色谱柱压力对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离的影响较为复杂。在不同的温度条件下，色谱柱压力对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离的影响不同，这是因为不同温度条件下的压力对超临界CO2流体的溶解能力以及扩散系数的影响不同。鉴于色谱柱温度的提高有利于鱼油脂肪酸EPA和DHA分离，因此选取在50℃、10% ETOH条件下得到的结果为例，分析压力因素对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离的影响。由表2可知，在50℃、10% ETOH条件下，与温度的影响规律截然相反，随着色谱柱压力的逐渐增大，鱼油脂肪酸EPA和DHA的滞留时间逐渐减小，这很可能是由于压力的增大影响了鱼油脂肪酸分子在固定相表面的吸附以及CO2流体的扩散。此外，在50℃、10% ETOH条件下，虽然降低色谱柱的压力有利于鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离，但是考虑到超临界设备的耐压能力以及为了提高后续分离纯化鱼油脂肪酸EPA与DHA的效能着想，色谱柱的压力选择140 bar更为合适。

表2 压力对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离效果的影响

2.3 辅溶剂比例的影响

超临界流体色谱技术(SFC)一般采用CO2作为主流动相，辅溶剂的选择也以醇类为主的有机溶剂。由于流动相与固定相的极性相差非常大，因此辅溶剂微小比例的变化就会对分离效果带来较大的改变。由表3可知，在50℃、140 bar条件下，随着流动相中乙醇比例的增加，鱼油脂肪酸EPA和DHA的滞留时间逐渐减少，因此适当增加辅溶剂的比例有利于提高后期模拟移动床分离鱼油脂肪酸EPA和DHA的效能。不同的辅溶剂比例区间内，辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离效果的影响不同。这是因为当乙醇比例过低或者过高时，两相极性相差过大，导致鱼油脂肪酸EPA和DHA不易在固定相表面吸附，所以辅溶剂比例过高或者过低都会导致鱼油脂肪酸EPA和DHA之间的分离效果变差。对比实验结果可以得到，当辅溶剂比例为12%时，鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离常数的差值△K最大，同时二者的滞留时间也相对较小，因此辅溶剂比例选择12%更加有利于鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离。

表3 辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离效果的影响

2.4 分离影响的验证

本实验通过考察温度、压力和辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离影响，发现适当地提高温度和辅溶剂比例有利于实现鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离。本实验确定了该色谱条件下鱼油脂肪酸EPA和DHA最佳的分离条件，即以Viridis silica 2-EP(250 mm × 10 mm，5 μm)为色谱柱，流动相为含12%乙醇的CO2流体，流速为4 g/min，柱温度为50℃，柱压力为140 bar。现对该色谱条件下鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离影响进行验证。本次验证实验一共选取3组分离条件进行验证，其中包括最佳分离条件A(50℃、140 bar、12%乙醇)、分离条件B(50℃、140 bar、8%乙醇)、分离条件C(30℃、140 bar、12%乙醇)。由图1可以明显地看出，随着温度以及辅溶剂比例的增加，鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离效果越来越好。与此同时，结合表4可知，鱼油脂肪酸EPA和DHA的滞留时间也越来越短。因此适当提高温度和辅溶剂比例不仅有利于鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离，而且可以提高后期二者分离纯化的效能。虽然该色谱条件下的最佳分离条件A并没有实现鱼油脂肪酸EPA和DHA完全分离，但是该色谱条件下反映的各因素对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离的影响，为实现二者的分离提供了研究基础。

图1 不同分离条件下的鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离效果

表4 不同分离条件下的鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离效果

3 结论

本实验旨在探究温度、压力和辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离影响，为了能够更好地分析鱼油脂肪酸EPA和DHA的出峰情况，本实验并未采用混标法进行进样。本实验通过考察温度、压力和辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离影响，发现温度、压力和辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离都存在着一定的影响。其中压力对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离的影响最为复杂，主要表现为在不同的温度范围内，压力对二者的分离影响不同。相较之下，温度和辅溶剂比例对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离的影响比较直观，适当地提高温度和辅溶剂比例不仅可以增强二者的分离效果，而且可以提高后期鱼油脂肪酸EPA和DHA分离纯化的效能。该色谱条件下反映的各因素对鱼油脂肪酸EPA和DHA分离的影响，为鱼油脂肪酸EPA和DHA的分离纯化研究提供了良好的基础。