小型猪骨膜干细胞的分离与鉴定

王安鸿 史尉利 余慧镭 傅欣 段小宁 胡晓青 郭秦炜

北京大学第三医院运动医学科，北京大学运动医学研究所，运动医学关节伤病北京市重点实验室（北京100191）

关节软骨是关节重要的组成部分，能承受和平衡应力负荷，在关节活动中起着重要作用，关节软骨损伤后会造成疼痛等症状，影响关节活动，造成功能障碍，若得不到良好的治疗，会逐渐进展为骨关节炎，甚至导致残疾[1]。但软骨缺乏血管、神经、淋巴等组织，无法有效地进行自我修复，临床上的传统手术如微骨折术等又无法再生关节软骨[2，3]。自体软骨细胞移植需二次手术，操作复杂、耗时长，易造成移植物的增生肥大，且软骨细胞体外扩增时经常出现去分化和软骨细胞的表型无法维持稳定等问题[4-6]。因此，国内外开展了众多以多向潜能间充质干细胞为基础的组织工程技术用于修复关节软骨损伤，应用较多的主要有骨髓、滑膜和脂肪起源的干细胞[7]，但现有的研究表明这些干细胞修复效果不佳[8-10]。因此，寻找更为有效的种子细胞是目前组织工程的一项重要任务。Reinholz 等将兔胫骨近端内侧骨膜经转化生长因子β（transforming growth fac⁃tor，TGF-β）和胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）处理后体外培养，结果显示骨膜生发层的厚度和细胞数都显著增加，成软骨的能力也增加了近12 倍[11]。在他们的后续实验中，将兔骨膜经TGF-β预处理后，再将骨膜移植物移植到骨软骨缺损区，能促进缺损区的组织更新修复[12]。而在我们的前期研究中，在胫骨近端内侧骨膜下注射TGF-β后，骨膜的生发层可出现明显的增殖反应[13]。结合文献和我们的前期工作，推测动物骨膜的生发层可能存在骨膜祖细胞或骨膜起源的干细胞。鉴于此，本研究旨在从哺乳动物分离、鉴定骨膜干细胞，验证动物骨膜中存在骨膜起源的干细胞，探索为软骨损伤修复的组织工程技术提供细胞来源。

1 材料与方法

1.1 实验动物

贵州小香猪3 只，1月半（离乳，未成年），体重约15 kg。本实验已通过北京大学生物医学伦理审查委员会审批。

1.2 实验材料

DMEM培养基（Thermo Fisher，31600034）、FITC标记的鼠抗猪单克隆抗体CD90（BD Pharmingen，555595）、PE 标记的鼠抗猪的单克隆抗体CD105（EX⁃BIO，1P-453-T100）、FITC标记的鼠抗猪的单克隆抗体CD45（INVITROGEN，MA5-28383）、APC标记的鼠抗猪的单克隆抗体CD44（EXBIO，1A-341-T100）、FITC 标记的鼠抗猪的单克隆抗体CD14（INVITROGEN，MA5-28286）、Ⅰ型胶原酶、Ⅱ型胶原酶、青霉素、链霉素、PBS、胎牛血清、成骨诱导分化培养基试剂盒（Cyagen，HUXMA-90021）、成软骨诱导分化培养基试剂盒（Cya⁃gen，HUXMA-90041）、成脂肪诱导分化培养基试剂盒（Cyagen，HUXMA-90031）、离心机、流式细胞仪（Flow Cytometer，FCM）、倒置相差显微镜及照相系统（LEICA）等。

1.3 骨膜来源的细胞分离培养

分离：取猪髂骨近端内侧骨膜，加入含I00 UI/ml青霉素G，100 UI/ml 链霉素的PBS 中，在浓度为500 UI/ml抗生素（双抗）浸泡10 min，PBS冲洗3遍，眼科剪剪碎成匀浆。消化：准备含10%胎牛血清（FBS）和上述浓度抗生素的DMEM 培养基，加入0.125%Ⅰ型胶原酶+0.125%Ⅱ型胶原酶，37℃消化4.5 h 左右。6000 r离心，4 min，悬浮置于培养皿中。培养：将上述培养皿放置于标准的细胞培养条件中（95%的潮湿空气，5%的CO2）培养3 天，3 天后观察细胞形态，见散在的具有干细胞形态的细胞，每周换液2 次。2 周后观察，细胞增殖迅速。

1.4 流式细胞学表面标志鉴定

细胞培养至P3 代，4℃，PBS 清洗3 遍，调整密度约为2.5×106/mL，加入APC、FITC 或PE 标记的抗CD90，CD44，CD105，CD14，CD45的单克隆抗体4 μL，避光孵育30～45 min，流式细胞学分析。

1.5 三系分化

1.5.1 成骨分化

当细胞融合度达到80%～90%时，用0.25%Tryp⁃sin-0.04%EDTA进行消化。将消化下来的细胞按照2×104 cells/cm2的细胞密度接种在事先包被0.1%明胶的六孔板中，每孔加入2 mL 完全培养基。将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。当细胞融合度达到60%～70%时，小心地将孔内完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL 干细胞成骨诱导分化完全培养基。每隔3天换用新鲜的干细胞成骨诱导分化完全培养基（使用前需预热至37℃）诱导2～4周后，视细胞的形态变化及生长情况，用茜素红进行染色。成骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成骨诱导分化完全培养基，用1×PBS 冲洗1～2 次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 冲洗2次。每孔中加入1 mL 茜素红染液染3～5 min。吸走茜素红染液，用1×PBS 冲洗2～3 次。将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。

1.5.2 成软骨分化

进行成软骨诱导分化实验之前，需要对常规消化后的细胞进行计数。将3～4×105个细胞转移到15 mL离心管中，250 g离心4 min。吸去上清。加入0.5 mL预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗细胞，室温下150 g 离心5 min。重复步骤3，再次清洗细胞。将上一步所得沉淀用0.5 mL 干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬。室温下150 g 离心5 min。拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5% CO2的培养箱中培养。成软骨诱导分化结束后，吸走六孔板中的成软骨诱导分化完全培养基，用1×PBS 冲洗1～2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 冲洗2 次。每孔中加入1 mL阿利辛蓝染液染3～5 min。吸走阿利辛蓝染液，用1×PBS冲洗2～3次。将培养板置于显微镜下观察成软骨染色效果。

1.5.3 成脂分化

当细胞融合度达到80%～90%时，用0.25%Tryp⁃sin-0.04%EDTA 进行消化。消化下来的细胞按照2×104 cells/cm2的细胞密度接种在六孔板中，每孔加入2 mL 完全培养基。将细胞置于37℃，5% CO2的培养箱中进行培养。每隔3 天换液，直到细胞融合度达到100%或者过融合。小心地将间质干细胞完全培养基吸走，向六孔板中加入2 mL干细胞成脂诱导分化培养基A液。诱导3天后，吸走六孔板中的A液，加入2 mL干细胞成脂诱导分化培养基B液。24 h后，吸走B液，换回A 液进行诱导。 A 液和B 液交替作用3～5 次后（12～20天），继续用B 液维持培养4～7天直到脂滴变得足够大、圆。B液维持培养期间，每隔2～3天需要换用新鲜的B 液。成脂诱导分化结束后，吸走六孔板中的干细胞成脂诱导分化培养基，用1×PBS 冲洗1～2次。每孔加入2 mL 4%中性甲醛溶液，固定30 min。吸走中性甲醛溶液，用1×PBS 冲洗2 次。每孔中加入1 mL 油红O 染料工作液染色30 min。吸走油红O 染液，用1×PBS 冲洗2～3 次。将培养板置于显微镜下观察成脂染色效果。

2 结果

2.1 细胞形态学观察

从骨膜分离的细胞体外培养约3 周后，在倒差显微镜下观察，可见大量细胞，细胞胞体较大，细胞呈梭形或不规则三角形生长，胞质向外伸出长短不同的突起，排列整齐。见图1。

图1 骨膜分离的细胞体外培养3周的细胞形态（×10）

2.2 流式细胞学鉴定结果

本研究选用CD44、CD90、CD105、CD14 和CD45 进行流式细胞学检测，结果显示，从骨膜分离的细胞表达CD44、CD90 和CD105，而CD14 和CD45 呈阴性表达。见图2。这表明从骨膜分离的细胞能表达间充质干细胞特异的表面抗原。

图2 流式细胞学检测结果

2.3 三系分化

骨膜分离的细胞经成骨、成软骨、成脂诱导试剂盒诱导分化2 周后，分别经茜素红、阿利辛蓝和油红O 染色。经茜素红染色后，钙化的细胞外基质呈红色（图3A），证明其向成骨分化；成软骨培养基诱导蛋白多糖沉积，可见大量被阿利辛蓝染为蓝色的细胞（图3B）；而油红O 将脂滴或脂肪空泡染为红色，表明其向脂肪组织分化（图3C）。结果显示骨膜分离的细胞具有干细胞特性，可向三系分化，即成骨、成软骨和成脂肪分化。

图3 三系分化结果

3 讨论

为修复关节软骨缺损，研究者开展了大量的研究工作，其中比较有代表性的是自体软骨细胞移植技术和组织工程技术。自体软骨细胞移植技术及其迭代技术是从关节的非负重区获取软骨组织、体外分离软骨细胞，经3～8 周的扩增，再通过二次手术将扩增的软骨细胞植入软骨缺损区，覆盖以骨膜移植物或Ⅰ/Ⅲ型胶原膜。自体软骨细胞移植虽可产生透明软骨样的修复，但移植物的增生肥大是限制其应用的最大挑战。Bartlett 等[14]利用基质诱导的自体软骨细胞移植术修复膝关节股骨内侧髁和髌骨骨软骨损伤，在术后6月接受关节镜评估的4位患者中，有1位发生了移植物的肥大，而需进一步刮除。他们进一步比较了自体软骨细胞移植术和基质诱导的软骨细胞移植术的效果，发现术后1年自体软骨细胞移植术（autologous chondrocyteimplantation，ACI）的移植物肥大率为9%（4/44），而基质诱导的自体软骨细胞移植术（matix -autologouschondrocyte implantation，MACI）的移植物肥大率为6%（3/47），并且每组的再手术率都达9%[15]。Gomoll 等[16]在一项队列研究中对比了骨膜移植的ACI和基质膜移植的ACI的术后移植物肥大发生率，在术后1年通过移植物位置的疼痛症状和核磁共振检查，发现25.7%的用骨膜作移植物的ACI 患者因移植物肥大而需再手术，而以基质膜覆盖的ACI 患者5%因移植物肥大而需再手术。这表明移植物的增生肥大仍然是ACI类技术的主要问题。

利用组织工程技术修复关节软骨是当前研究的热点，通过体外培养、扩增种子细胞，并将扩增的种子细胞植于具有良好生物组织相容性和降解性的支架材料中，然后植入软骨缺损的部位，在一定的调控状态下完成关节软骨的修复和重建。组织工程中目前最常用的种子细胞是骨髓干细胞，研究表明[17]将骨髓干细胞移植到软骨缺损区后，可产生透明软骨样的组织；但也有研究者将骨髓干细胞移植于裸鼠皮下后，产生了软骨内钙化[8]。并且，随着体外的扩增传代，骨髓干细胞的成软骨分化潜能会逐渐降低，而钙化（成骨分化）增加，且获取这些细胞会造成患者的疼痛和供区并发症[7]。这表明骨髓干细胞移植可能会造成移植区钙化等问题。关节滑膜起源的干细胞获取方便，体外扩增速度快，体外成软骨分化可较骨髓干细胞产生更多软骨细胞[18]，但将其移植到体内分化时，其胶原含量会逐渐下降[8]，不利于软骨修复。骨膜干细胞体外扩增速度较快，具有更好的体外成软骨分化的能力[19，20]，研究者将骨膜干细胞连续三代移植于小鼠脂肪垫后，骨膜干细胞仍能保持自我更新的潜能[21]。Wakitani 等[17]将骨髓干细胞和骨膜干细胞分别移植于兔股骨内侧髁软骨缺损模型后，发现缺损区均可产生透明软骨样的修复，而骨膜干细胞修复的软骨表面更加规整，与周围正常的关节软骨整合更好。这表明相较于其他组织来源的干细胞，骨膜干细胞具有更稳定、更持久的软骨分化潜能。

骨膜在关节置换术中可能作为废物而被丢弃，但它可能是自体干细胞的重要来源[22]。在本次研究中，从骨膜分离的细胞在P3 代时镜下观察呈现长梭形或纤维状，这与文献报道骨膜分离的细胞形态相似[22，23]。表面抗原可用来鉴定骨膜来源的前体细胞，其中CD105 是TGF-β受体的重要组分，在成软骨分化中具有重要作用，Lim等研究者分离、体外培养人PDPCs时，CD105 表型能保持至P15[24]。CD90 和CD44 也是间充质干细胞鉴定常用的表面标志，能在间充质干细胞和骨膜来源的前体细胞中高表达[25-27]。CD45 和CD14 是造血细胞系的表面标志，不会在间充质干细胞中表达[23，25，28]。本实验结果显示从骨膜分离的细胞能表达CD44、CD90 和CD105，而CD14 和CD45 表面标记呈阴性表达；这说明从骨膜分离的细胞具有间充质干细胞的表型特征。

能向骨、软骨、脂肪分化是鉴定间充质干细胞的标准[7，29]。Lim等研究者的实验证明从人骨膜分离的细胞在体外培养至P15 时仍能保持成软骨的能力[24]。Yoon等的研究结果也表明人骨膜分离的细胞可向骨、软骨和脂肪进行分化[30]。Jaquiery等比较了人下颌骨骨膜来源的细胞和骨髓的间充质干细胞，发现骨膜来源的细胞成骨能力不如骨髓来源的间充质干细胞[31]。而Wakitani 等的研究表明兔骨膜来源的细胞成软骨的能力较骨髓来源的间充质干细胞强[17]。Choi 等在诱导人骨膜来源的细胞成脂分化时，发现形成的脂肪空泡小且多，都在核的周围，且空泡随着成脂分化的过程而不断增大[27]。在本次实验中，从骨膜分离的细胞能向骨、软骨和脂肪进行分化。我们观察到，从骨膜分离的细胞在成骨诱导分化2周后，经茜素红染色，在镜下可见典型红染的钙化结节；经成软骨诱导分化14 天后，可见大量蓝染的细胞；而在成脂诱导分化14 天左右，可见部分红染的脂滴，且随成脂诱导分化的时间延长，脂滴并无明显增加。这可能表明成骨分化和成软骨分化的染色较成脂分化更强。我们推测可能骨膜分离的细胞更倾向于向骨和软骨细胞系分化，可能有更好的成骨和成软骨分化的能力，而成脂分化的能力较差；但这尚需进一步研究验证。

从骨膜分离的细胞能表达间充质干细胞特异性的表面标志，还能诱导向成骨、成软骨和成脂分化。因此，本研究从小型猪骨膜分离的细胞可被认为是间充质干细胞。

4 结论

本研究成功分离并鉴定了小型猪的骨膜来源的干细胞，为软骨缺损修复的组织工程技术提供了种子细胞来源。