中国广东地区膝骨关节炎患者与健康人群肠道菌群差异性分析

卢耀鸣 郭达 卢晓敏 钟礼伦 邓铭聪 吴柯柯 牛维 刘军 林定坤

广东省中医院骨科，广东 广州 510120

退行性膝关节炎是以关节疼痛、活动受限、软骨磨损为主要表现的疾病[1]。在发病过程中，以肥胖、血脂异常、血糖异常等为表现的代谢功能紊乱是影响骨关节炎进展的重要原因[2]。肠道菌群是寄生在动物体内肠道环境的微生物的总称，其种类繁多，功能复杂，是人体的“隐形器官”[3]，与代谢性疾病的发展过程密切相关。早期涉及肠道微生物组-关节轴中啮齿动物模型和人体研究发现[4]，其与炎症标志物水平升高如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)存在相关性，这表明微生物源性促炎性代谢产物是骨关节炎发生发病的参与者。对肠道菌群及其与免疫对膝骨关节炎(osteoarthritis，OA)影响的文献回顾发现：存在肠道菌群种类或数量改变、比例失衡等紊乱时，可能通过影响肠上皮细胞的通透性或激活肠上皮细胞的炎症因子，扩大炎症反应，造成了软骨破坏，促进OA进程[5]。

本文对中国广东地区健康人群及骨关节炎患者粪便菌群测试与分析，结合临床资料，探讨人群间肠道菌群差异，并对代谢指标进行分析，初步探讨膝骨关节炎人群与健康人群肠道菌群差异性。

1 资料与方法

1.1 研究对象及样本采集

选取2017年6～12月纳入我院的健康人群29例，轻度关节炎患者17例及重度关节炎患者49例作为研究对象。关节炎组纳入标准：①类风湿、风湿、自免、感染等指标检测无异常；②无高血压、冠心病等内科合并症，有关节疼痛、活动受限等病史，X线检查关节炎分级(K-L分型)>1级，既往无膝关节外伤及手术史，无关节外畸形；③粪便寄生虫检测正常，既往无排便异常或消化道疾病发作史；④既往无长时间服用抗生素史，现采集标本前抗菌或抑菌药物停用时间>1年；⑤自愿加入“中国南方人群粪便菌群样本库和患者临床资料库”并签署知情同意书者；⑥根据2018年骨关节炎诊疗指南[6]排除存在其他部位关节炎的情况。健康人群对照组纳入标准：①类风湿、风湿、自免、感染等指标检测无异常；②无高血压、冠心病等内科合并症，无关节疼痛、活动受限等病史，X线检查关节炎分级(K-L分型)≤1级，既往无膝关节外伤及手术史，无关节外畸形；③粪便寄生虫检测正常，既往无排便异常或消化道疾病发作史；④既往无长时间服用抗生素史，现采集标本前抗菌或抑菌药物停用时间>1年；⑤自愿加入“中国南方人群粪便菌群样本库和患者临床资料库”并签署知情同意书者；⑥根据2018年骨关节炎诊疗指南[6]排除存在其他部位关节炎的情况。该研究的伦理委员会批注编号：Z2017-110。

1.2 研究方法

两组人群标本采集前均进行详细的病史采集，所有信息录入ACCESS数据库并进行校对处理。患者或志愿者排便后，用无菌拭子取花生粒大小样本冻存或放保护液中。血液样本于入院检查时一并提取。按照《粪便菌群DNA提取试剂盒》操作说明提取肠道菌群DNA。提取核酸后交宏基因组检测公司检测，检测流程按SOP流程执行。

1.3 膝骨关节炎肠道菌群微生物测序与分析

参照试剂盒说明书提取受试者的肠道菌群DNA，PCR扩增后上机测序。对测序数据进行分析并进行样本区分，同时针对数据进行Q20、Q30等质控分析、数据过滤。对最终获得数据进行OUT归并划分，在此基础上进行ALPHA多样性分析，评估样本多样性水平和丰度分布，各样本(组)在不同分类水平的具体组成，并检验组间是否具有统计学差异；BETA多样性分析进一步衡量不同样本(组)间的菌群结构差异及关键物种筛选。使用Simpson多样性指数分析群落多样性，使LEfSe分析对群落关键物种进行筛选；差异物种GO分析及Pathway分析进行差异性菌群代谢功能预测。

2 结果

2.1 研究对象临床信息

对纳入研究的不同程度关节炎患者、正常健康人群者的临床信息进行收集，用SPSS 23软件对三组数据使用单因素方差分析(One Way ANOVA)进行统计分析(表1)。三组研究对象在年龄、身高、体重均无明显差异，在血脂和血糖水平上差异明显；且在血脂、血糖、血胆固醇两两比较的统计中，健康人群组与关节炎组相比血脂与血糖具有明显统计学差异，而血胆固醇则差异不明显；而两种程度关节炎组相比血脂、血糖及血胆固醇差异均不明显。

表 1 纳入研究样本的临床信息汇总对比Table 1 Comparison and summary of all the clinical information of the study subjects

2.2 膝骨关节炎患者肠道菌群宏基因组物种鉴定

Simpson多样性指数是评价微生物群落Alpha多样性的常用指数之一，Simpson指数值越高，表明群落多样性越高。膝关节炎患者与健康人群对比发现，其肠道菌群多样性低于健康人群(图1 A)。将膝骨关节炎患者分为轻度、重度后，轻度患者与健康人群肠道菌群多样性无显著差异，重度患者肠道微生物多样性显著低于健康人群(图1B)。

图1 目标人群肠道菌群多样性Shannon指数探究 A：健康人与膝关节炎患者肠道菌群多样性对比；B：健康人、轻度膝关节炎患者、重度膝关节炎患者三组肠道菌群多样性对比Fig.1 Shannon index of intestinal flora diversity in target population. A: Comparison of intestinal flora diversity between healthy people (Hg) and patients with knee arthritis (KO); B: Comparison of intestinal flora diversity among healthy people (Hg), patients with mild knee arthritis (KL1), and patients with severe knee arthritis (KL 2)

LEfSe分析是将线性判别分析与非参数的Kruskal-Wallis以及Wilcoxon秩和检验相结合，从而筛选关键的生物标志物。通过LEfSe分析发现，寡养单胞菌属(Stenotrphomonas)、黄单胞菌属(Xanthomonadacease)等18种菌群在膝关节炎人群中显著高丰度，毛螺旋菌属(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌属(Ruminococcus)等6种菌群在膝关节炎人群中显著低丰度。将膝关节炎人群分轻、重度两个亚组后发现，寡养单胞菌属、黄单胞菌属两类菌群可以显著区分轻重型膝骨关节炎，是一种潜在的诊断标志物，其机制及普遍性正在进一步研究中。见图2。

图2 不同目标人群具有显著差异的肠道菌群种属 A：健康人与膝关节炎患者对比；B：健康人、轻度膝关节炎患者、重度膝关节炎患者对比。纵坐标为组间具有显著差异的分类单元，横坐标条形图为对应分类单元的LDA差异分析对数得分值，按得分值大小排序，以此描述它们在不同分组样本中的差异大小。长度体现分类单元的差异性，条形图颜色指示分类单元所对应的丰度较高的样本分组Fig.2 Species of intestinal flora with significant difference among different target populations. A: Comparison between healthy people (Hg) and patients with knee arthritis (KO); B: Healthy people (Hg), patients with mild knee arthritis (KL 1), and patients with severe knee arthritis (KL 2) were compared. The ordinate is the taxon with significant difference between groups, and the abscissa bar chart is the logarithm score value of LDA difference analysis of corresponding taxon, which is sorted according to the score value, so as to describe their differences in different grouping samples. The length reflects the diversity of taxon, and the color of bar chart indicates the sample group with higher abundance.

2.3 差异物种GO分析及Pathway分析

膝关节炎人群相对于健康人中差异性微生物(P<0.05)GO分析及Pathway分析显示，与正常健康人相比，膝关节炎人群肠道差异性菌群在分子功能、生物过程、细胞组成存在显著差异，包括细胞增殖过程的影响、机体系统的影响、人体疾病产生的影响等，具体对机体影响较大的功能富集结果见图3。结果中寡养单胞菌属、黄单胞菌属等菌群显著升高，对代谢类疾病、感染性疾病、心血管类疾病、免疫性疾病的发病具有增加的趋势；对细胞转移、细胞增殖等具有显著影响；对机体神经系统、免疫系统、代谢系统、消化系统等具有巨大的影响，这些影响与膝骨关节炎的发病不无关系。

图3 不同人群肠道差异性菌群代谢功能预测，红色为健康人，蓝绿色为膝关节炎人群。“小提琴”的“胖瘦”反映了样本数据分布的密度高低(宽度越宽，表明该丰度下对应的样本越多)；箱线图边框代表上下四分位数间距(interquartile range，IQR)，横线代表中位值，上下触须分别代表上下四分位以外的1.5倍IQR范围，符号“•”表示超过范围的极端值Fig.3 The prediction of metabolic function of intestinal flora in different populations. Red is healthy people, and blue-green is knee arthritis population. The “fat and thin” of “Violin” reflects the density of the sample data distribution (the wider the width, the more samples corresponding to the abundance). The border of the box diagram represents the interquartile range (IQR). The horizontal line represents the median value. The upper and lower tentacles represent the 1.5 times IQR range beyond the upper and lower quartiles. The symbol “·” indicates the extreme value beyond the range.

通过KEGG注释(包括 KOs、Enzymes、Modules及Pathways 4个层面对蛋白分子的生物学功能进行标注)，对差异性菌群进行了代谢功能分析(图4)，结果显示，膝关节炎人群肠道菌群环境对机体的氨基酸代谢、糖代谢、脂质体代谢、核苷酸代谢、糖类合成与代谢等关系密切；并且黄单胞菌属等菌群与肠道内生物降解与代谢、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢辅助因子和维生素代谢等也关系密切。

3 讨论

肠道微生物组-关节轴的研究是一个新兴的研究领域。Collins等[7]对高脂/高糖饮食喂养的大鼠研究中发现，肥胖动物软骨损伤增加、血清LPS水平和Mankin组织学评分之间存在直接相关；16S测序发现，肠道微生物组组成中乳酸杆菌属和甲烷杆菌属菌群增加，丰度与组织学评分有预测关系。Ulici等[8]对无菌小鼠研究发现，无菌状态下，创伤后骨关节炎严重程度有所降低；提示肠道微生物组骨关节炎发病机理中发挥作用。本研究发现，健康人群组肠道菌群与KOA组，在菌群数量占比以及菌种的比较上均有明显差异。在菌群多样性上，健康人组与轻度KOA组差异不大，而轻、重度关节炎组相比差异性较大。从菌群物种统计及LDA差异分析发现，寡养单胞菌属、黄单胞菌属等18种菌群在KOA人群中呈显著高丰度，毛螺旋菌属、瘤胃球菌属等6种菌群在KOA人群中呈显著低丰度。按KOA程度分为轻、重两个亚组后发现，寡养单胞菌属、黄单胞菌属两类菌群可以显著区分轻重度KOA。

图4 膝关节炎人群肠道差异性菌群代谢功能预测，图中横坐标为KEGG第二等级功能类群，纵坐标为各功能类群在各样本(组)内的相对丰度Fig.4 The abscissa is the second level functional group of KEGG. The ordinate is the relative abundance of each functional group in each sample (group)

通过差异物种GO分析及Pathway分析提示关节炎人群肠道菌群环境对机体的氨基酸、糖、脂质、核苷酸、糖类合成与代谢等关系密切；黄单胞菌属等菌群与肠道内生物降解与代谢、萜类化合物和聚酮类化合物的代谢辅助因子和维生素代谢等也关系密切。嗜麦芽寡养单胞菌作为革兰氏阴性菌的一种，其菌株内含有Ⅱ型分泌系统是革兰阴性菌的常规代谢途径，其向胞外分泌多种蛋白，包括蛋白酶、内毒素等相关物质。辛晓妮等[9]通过PCR扩增、测序的方法发现嗜麦芽寡养单胞菌分泌系统基因簇中的GspF和GspE序列在种内高度保守，与其他菌株有显著差异，提示其Ⅱ型分泌系统机制可能显著区别于其他革兰阴性菌，这为深入研究寡养单胞菌属与关节炎发病机制的关系提供一定研究方向。本研究基线比较中可观察带关节炎患者的血糖、血脂显著高于健康者，结合差异物种GO分析及Pathway分析，提示相关菌群可能通过代谢途径影响骨关节炎的进程的理论可能性。

黄单胞菌属菌群中，甘蓝黑腐病黄单胞菌具有分泌细胞外杂多糖——黄原胶(Xanthan gum)的能力[10]。其理化性质与透明质酸钠相近，而透明质酸是广泛认可的防止骨关节炎进展的关节腔注射首选药物。Han等[11]通过兔骨关节炎的体内外实验研究发现，黄原胶有保护关节软骨的作用，但黄原胶与肠道菌群及骨关节炎的关系尚未明确，仍需进一步实验探讨。

在低丰度菌种中，毛螺旋菌属有可能与免疫性疾病相关。陈小玉等[12]通过对初诊及非初诊再生障碍性贫血患者群体进行干细胞移植前后肠道菌群比较发现，初诊组及非初诊组毛螺菌科比对照组降低，移植前组毛螺菌科也比对照组降低。骨关节炎作为代谢性及免疫性疾病的一种，其发生发展无不与免疫系统相关，在此实验理论基础上进行深入研究挖掘，有助于探讨毛螺旋菌属与骨关节炎发病机制的具体关联。

当前研究发现健康人群与关节炎人群粪便菌群结构有明显不同，样本量局限于中国广东地区，由于饮食、地域等因素单一样本的代表性并不一定能为潜在机理提供支持证据。在中国，不同地方常住人口也有不同民族之分，其饮食结构也能导致肠道菌群结构的差异[13]，对不同人群的饮食及人群特点进行分析，有助于揭示肠道菌群与OA发病相关机制；开展对显著丰度差异的菌属研究，探索肠道菌群介导OA的发病机制有可能为骨关节炎的防治研究提供新方向。