SH2B3 基因单核苷酸多态性与自身免疫性肝病相关性分析

汤斌斌 余 光 王宏刚 莫霏霏 王国祥

自身免疫性肝病是一组病因不明，与自身免疫异常有关的肝组织损伤、肝功能异常疾病[1]。根据其临床表现、免疫学、生化、组织病理学特点，主要分为自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）、原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、原发性硬化性胆管炎等，其中较常见的两种自身免疫性肝病为PBC 和AIH[2]。自身免疫性肝病无特异性临床病症，确诊时间晚，危害严重，目前缺乏明确的诊断标准[3]。SH2B 衔接蛋白3（SH2B3）属于SH2B 衔接蛋白家族中的成员，是一种细胞内衔接蛋白，在多种信号转导途径中作为负调节物而发挥作用，包括炎症信号通路[4-5]。Zhou 等[6]研究表明，人类染色体12q24 位点以SH2B3 和ATXN2 基因为核心，与1 型糖尿病、类风湿性关节炎、红斑狼疮、多发性硬化等自身免疫疾病有关。本研究通过对SH2B3 基因中Rs3184504 的单核苷酸多态性进行探究，进而探讨SH2B3 基因单核苷酸多态性与自身免疫性肝病的关联性，以期为自身免疫性肝病患者提供潜在的基因诊断标志物。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013 年7 月—2020 年1 月于浙江省台州市立医院就诊的自身免疫性肝病患者162 例为研究对象，其中PBC 患者84 例（PBC 组），年龄34～67 岁；AIH 患者78 例（AIH 组），年龄33～68岁；同期选取健康体检者72 名为对照组，年龄33～67岁。本实验经医院伦理委员会审核通过，符合《赫尔辛基宣言》伦理原则；所有受试对象均由专业人员详细告知研究内容并自愿参加，同时签署知情同意书。

1.2 纳入标准 （1）PBC 和AIH 诊断参照《自身免疫性肝病诊断和治疗指南》[7]中的相关标准；（2）不伴有肝癌或其他恶性肿瘤者；（3）临床资料保存完整者；（4）研究对象均为汉族人群，年龄≥18 岁，性别不限。

1.3 排除标准 （1）伴有严重心血管疾病、肾脏疾病等严重疾病者；（2）伴有急慢性感染性疾病及各种免疫系统疾病者；（3）妊娠期或哺乳期妇女。

1.4 主要试剂与仪器 血液基因组DNA 提取试剂盒（批号DK604）购自上海莱枫生物科技有限公司；PCR buffer Set（PCR buffer 及MgCl2 稀释液，批号11160010-1）购自苏州瑞诺德生物科技有限公司；白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（批号SEKH-0020）购自北京索莱宝科技有限公司；白细胞介素-17（interleukin-17，IL-17）ELISA 试剂盒（批号orb405970）购自武汉博欧特生物科技有限公司。PUZS-300 型自动生化分析仪购自上海帝博思生物科技有限公司

1.5 研究方法

1.5.1 血清学指标测定 抽取三组受试者清晨空腹外周静脉血样，置于-80℃保存。ELISA 法检测血清IL-12、IL-17 表达水平；常规自动生化分析仪测定丙氨酸氨基转移酶（alanineaminotrarsferase，ALT）和γ-谷氨酰转肽酶（γ-Glutamyltranspeptidase，GGT）水平。操作步骤严格按照试剂盒及仪器使用说明书进行。

1.5.2 SH2B3 基因单核苷酸多态性检测 参照试剂盒说明书提取外周血DNA，核酸定量仪测定A260/A280，计算DNA 纯度和浓度，并将浓度稀释到50ng/μL，-20℃保存。引物由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 引物序列（见表1）。反应体系共25μL：10×PCR Buffer 2.5μL，MgCl21.5μL，上下游引物各0.5μL，dNTP 2.0μL，模 板DNA 2.0μL，Taq DNA polymerase 0.2μL，ddH2O 15.8μL。反应条件：95℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃1min，40 个循环。琼脂糖凝胶电泳后采用凝胶成像仪分析，将单一明亮条带的PCR 产物送上海生工生物工程有限公司纯化并测序，BLAST 进行测序结果比对。

1.6 统计学方法 应用SPSS 23.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（） 表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较行t 检验；计数资料以[例/百分比（%）]表示，行χ2检验；Logistic 回归分析影响PBC、AIH 发生的因素。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组一般资料比较 三组研究对象年龄、性别、病程、体质指数（BMI）、吸烟比例、饮酒比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

2.2 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验 结果显示，SH2B3 在rs3184504 的多态位点上有三种基因型，分别为CC 型、CT 型、TT 型。对照组基因型中CC 型最多，其次为CT 型，TT 型最少；PBC 组基因型中CT 型最多，其次为CC 型，TT 型最少；AIH 组基因型中CC型最多，其次为CT 型，TT 型最少；PBC 组、AIH 组中CT、TT 两种基因型占比明显较对照组升高（P＜0.05）。根据Hardy-Weinberg 平衡定律，对照组、PBC组及AIH 组各基因型的期望值和观测值符合Hardy-Weinberg 平衡定律（P 均＞0.05），提示群体来自同一孟德尔群体，所选样本进行群体遗传学研究具有代表性。见表3。

2.3 PBC、AIH 患者各基因型血清学指标比较 PBC、AIH 患者各基因型ALT、GGT、IL-12、IL-17 水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

2.4 影响PBC、AIH 发生的多因素分析 将PBC、AIH 是否发生作为因变量，校正年龄、性别、BMI、吸烟比例、饮酒比例、ALT、GGT、IL-12、IL-17 等混杂因素后，以SH2B3 三种基因型（CC 型、CT 型、TT 型）为自变量进行Logistic 回归分析，结果显示CT 型、TT型基因型是影响PBC 发生的独立危险因素（P＜0.05），TT 型基因型是影响AIH 发生的独立危险因素（P＜0.05）。见表5-6。

3 讨论

目前较为常见的自身免疫性肝病为PBC 和AIH[8]，PBC 是一种非化脓性、慢性胆管炎，血清生化异常以ALT 和GGT 升高最为常见[9-10]。AIH 无特异性临床症状和体征，AIH 常见的生化异常是血清ALT 和天冬氨酸氨基转移酶水平升高[11-12]。研究表明，基因多态性与自身免疫性肝病易感性相关[13]。

SH2B3 基因是衔接蛋白SH2B 家族的一个成员，参与多种信号事件的整合和调控[14]。SH2B3 参与细胞因子信号传导途径，是T 细胞受体信号传导的负性介质[15]。SH2B3 在内皮细胞中作为负调节因子抑制肿瘤坏死因子信号，进而降低促炎性反应，SH2B3 在动脉粥样硬化和血压调节等过程中也发挥重要作用[16-17]。Umemura 等[18]对158 例AIH 患者的SH2B3 基因型进行分析探究，证明SH2B3 中的rs3184504 的错义突变与AIH 有关。本研究中对照组基因型中CC 型（占84.72%）最多，其次为CT 型（占13.89%），TT 型（占1.39%）最少；PBC 组基因型中CT型（占46.43%）最多，其次为CC 型（占41.67%），TT型（占11.90%）最少；AIH 组基因型中CC 型（占50.00%）最多，其次为CT 型（占35.90%），TT 型（占14.10%）最少，PBC 组、AIH 组中CT、TT 两种基因型占比明显较对照组升高（P＜0.05）。提示CT、TT 基因型携带者比CC 基因型携带者的患病风险可能更高，分析Rs3184504 位点T 等位基因可能是自身免疫性肝病易感基因。唐莹莹[19]研究表明，除血清ALT 和GGT 外，IL-17 也参与了自身免疫性肝病的发生、发展，可引起肝脏免疫炎症反应。本研究中各基因型患者ALT、GGT、IL-12、IL-17 表达水平差异均有统计学意义（P＜0.05）。认为PBC 组、AIH 组患者体内SH2B3 基因型表达异常可能影响患者体内免疫调节机制，即T 细胞与Th17 细胞之间的平衡，而由Th17细胞分泌产生的IL-17 等炎症因子表达水平的异常，可能成为自身免疫性肝病发生的主要免疫因素。Logistic 回归分析结果显示，CT 型、TT 型基因型是影响PBC 发生的独立危险因素（P＜0.05），TT 型基因型是影响AIH 发生的独立危险因素（P＜0.05）。提示携带CT 型发生PBC 可能性较高，携带TT 型发生PBC、AIH 可能性均较高，携带SH2B3 基因rs3184504 T 等位基因者更容易罹患自身免疫性肝病。

表1 qRT-PCR 引物序列

表2 三组研究对象一般资料比较

表3 Hardy-Weinberg 遗传平衡检验结果[例（%）]

表4 PBC、AIH 患者各基因型血清学指标比较（）

表4 PBC、AIH 患者各基因型血清学指标比较（）

注：PBC 组为原发性胆汁性肝硬化患者；AIH 组为自身免疫性肝炎患者；ALT 为丙氨酸氨基转移酶；GGT 为γ-谷氨酰转肽酶；IL-12 为白细胞介素-12；IL-17 为白细胞介素-17；与CC 组比较，aP＜0.05；与CT 组比较，bP＜0.05

表5 影响PBC 发生的多因素分析

表6 影响AIH 发生的多因素分析

综上所述，SH2B3 单核苷酸多态性与自身免疫性肝病有一定相关性，其中CT 型、TT 型基因型可能与PBC 发生有关，TT 型基因型可能与AIH 发生有关，临床上可通过检测SH2B3 基因型，对自身免疫性肝病做出初步预测，以便尽早干预和控制，对预防自身免疫性肝病的发生可能具有重要价值，同时为临床治疗PBC、AIH 开辟新思路和视野，但具体作用机制仍需进一步研究。