液相色谱法检测糕点中五种合成着色剂的条件优化

唐晓伟 晏锐锐 胥晶

摘 要：建立糕点中5种常用合成着色剂的高效液相色谱法检测方法。以乙醇∶乙腈=2∶1混合溶液为提取液，旋蒸后过柱净化，以初始流动相定容，上机检测。以0.02 mol/L乙酸铵-乙腈为流动相进行梯度洗脱，采用C18反相色谱柱，紫外检测器检测。回收率在90%～105%，检出限为2～3 mg/kg，该方法可用于糕点中合成着色剂的日常检测。

关键词：合成着色剂;糕点;高效液相色谱

糕点是生活中不可缺少的主要休闲食品，因其香甜的口感、别致的外形受到人们尤其是小朋友的喜爱。2019年，全国糕点行业收入3 800亿元，其中针对幼年群体的产品份额达到1 344亿元，总比达到35.4%。随着糕点行业的快速发展，一些商家为了在外观口感上出新，追求靓丽的造型，人为加入某些人工合成着色剂。与天然色素相比，人工合成类着色剂具有价格低廉、性质稳定、色彩艳丽等优点。然而，合成类着色剂多以石油化工产品为原料，经过磺化、硝化等反应后得到的[1]，本身带有一定的毒性。长期超量食用，会影响儿童神经系统及骨骼的发育。目前，合成类着色剂的检测标准为GB 5009.35-2016。该标准样品范围并未包含糕点[2]，且国家对糕点类人工着色剂的使用限量未做明确要求。本文以

GB 5009.36-2016为参考，对糕点中常用的柠檬黄等5种合成着色剂建立液相色谱法检测方法，已取得满意结果。

1 材料与方法

1.1 實验样品

样品采用蜜饯类糕点，该糕点基质复杂，油脂、蛋白质、淀粉含量较高。

1.2 实验仪器

高效液相色谱仪（岛津LC-30A，配紫外检测器），电子天平（0.001 g，赛多利斯），高速离心机。

1.3 试剂耗材

柠檬黄、苋菜红、胭脂红、诱惑红与日落黄5种标准物质（海岸鸿蒙，浓度均为1 000 mg/L），乙酸铵（优级纯），磷酸氢二胺（优级纯），乙酸锌（优级纯），亚铁氰化钾（优级纯），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），聚酰胺固相萃取柱（dikma，150 mg/6 mL）。

1.4 仪器条件

检测波长430、483、510 nm，流速1 mL/min，进样量20 μL，梯度洗脱程序见表1。

8 000 r/min离心5 min，放置冰箱冷藏60 min，移取提取液5 mL，在40 ℃水浴条件下氮吹近干，加入3 mL甲醇溶解待用。

2.2 过柱步骤

活化：依次用5 mL甲醇、5 mL

10%甲酸水活化;上样：加入待净化液，弃去流出液;淋洗：加入5 mL甲醇，弃去流出液;洗脱：加入15%氨水甲醇溶液，收集流出液，在40 ℃条件下氮吹至干，用初始流动相定容至

1 mL，供分析。

3 结果与分析

3.1 标准曲线与检出限

用超纯水将5种合成着色剂分别配制成不同浓度的标准混合溶液，经液相色谱仪进样检测，以标准溶液浓度为横坐标，相应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得到5种合成着色剂的标准工作曲线;以3倍噪声比确定最低检出限。回归方程、线性范围、相关系数及检出限见表2。

3.2 检测波长的选择

根据标准物质光谱图（图1）得，5种着色剂的最佳检测波长为：柠檬黄428 nm、苋菜红521 nm、胭脂红509 nm、诱惑红509 nm以及日落黄483 nm。为方便识别与计算，在实际检测过程中采用如下波长：柠檬黄430 nm、苋菜红胭脂红诱惑红510 nm、日落黄483 nm进行

检测。

3.3 流动相的选择

本次研究采用了（a）0.02 mol/L乙酸铵-甲醇、（b）0.05 mol/L磷酸氢二铵-甲醇、（c）0.05 mol/L磷酸氢二铵-乙腈、（d）0.02 mol/L乙酸铵-乙腈流动相体系。结果表明，b、c体系中柠檬黄、苋菜红、胭脂红不能出峰，日落黄、诱惑红出峰但响应很低。a、d体系中5种目标物均能完全出峰，响应值良好。但是在a体系中胭脂红、日落黄、诱惑红响应时间间隔较近，易受到杂峰干扰。对于极性物质乙腈的溶解洗脱能力比甲醇强，且在实际进样过程中乙腈体系柱压比甲醇体系小15%，对色谱柱损耗较小，因此采用0.02 mol/L乙酸铵-乙腈体系进行洗脱。

3.4 流动相梯度选择

研究中试用了等度和梯度两种洗脱程序。在等度洗脱中，压力稳定，基线平衡性好，但是胭脂红、日落黄、诱惑红3个目标峰出现了连峰情况。此外，5个目标峰出峰时间较长，完成进样需要27 min。在梯度洗脱中，5个目标峰峰形良好且彼此独立。流动相浓度的变化会引起基线漂移，但不影响定量计算，在可接受范围内。经过优化，确定了2.4中的洗脱程序，进样时间共计15 min。

3.5 净化条件的选择

糕点中主要的干扰物质为脂肪、蛋白质及淀粉等，首先采用沉淀剂净化的方法。在研究中试验了常用的3种沉淀剂：①乙酸锌-亚铁氰化钾;②15%三氯乙酸[3];③硫酸锌-氢氧化钠。沉淀离心后，取上清液过柱定容，上机检测。结果表明，②体系仅对蛋白质有沉淀作用，对淀粉类物质无净化作用，处理后样液浑浊，杂质较多，不能进行上机分析的操作。①和③体系对样品净化作用较好，样液澄清。但回收率较低，尤其是柠檬黄和苋菜红，回收率不到30%。两种体系均是利用盐析反应使蛋白质变性沉淀，在此过程中盐对目标物可能具有吸附作用。在两种体系样品离心后产生的沉淀中，均发现带有目标物。因此沉淀剂净化方法不适用。

乙醇具有能使蛋白质变性沉淀的特点，同时淀粉、脂肪不溶于乙醇和乙腈。经过多次改良，最终确定乙醇∶乙腈=2∶1作为样品提取液，浓缩后过柱净化的处理方法。

4 目标物回收率

本次试验采用三水平六平行的加标验证模式。3组加标浓度5、10、

40 mg/kg，每组做6个平行样。平均回收率见表3。

5 样品检测结果

本实验的检测对象蜜饯中未检出这5种合成着色剂，为合格样品。

6 结论

本方法以国家标准GB 5009.35-2016为参考，建立了糕点中5种常用合成着色剂的液相色谱法检测流程，并对净化方法、仪器条件进行了探索性验证，最终确立了以乙醇∶乙腈=2∶1作为样品提取液，过柱净化，梯度洗脱的检测体系。目标物检出限符合当前市场质检需求，回收率在90%～110%，符合要求。针对含油量较高的样品，建议在离心后将样液放置在4 ℃冰箱中冷藏1 h，使脂肪在上层凝结析出，取中层样液过柱，提高净化效率。

参考文献

[1]厉芬，王凤丽，陈敏.食品常用合成色素搞笑液相色谱检测方法的改进[J].食品安全导刊，2018（33）：92.

[2]李明辉.高效液相色谱法同时测定糕点中6种合成着色剂[J].现代商贸工业，2018（33）：93.

[3]陈少迁，吴绍雄，柳陈坚.三氯乙酸沉淀液态奶蛋白质的最佳实验条件研究[J].乳业科学与技术，

2009（6）：278.

作者简介：唐晓伟（1989—），男，汉族，山东德州人，本科，助理工程师。研究方向：食品农产品检测。

晏锐锐（1984—），女，汉族，山东德州人，本科，助理工程师。研究方

向：食品农产品检测。

胥晶（1990—），女，汉族，山东

德州人，本科，助理工程师。研究方向：食品农产品检测。