中药复方鹿角胶丸防治绝经后骨质疏松症的机制研究

于冬冬 赵丹阳 杨芳 杨鸫祥 杨关林*

1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847 2.沈阳市第一人民医院，辽宁 沈阳 110041 3.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)发病机理复杂，常规药物长期服用依从性差，新药价格昂贵，难以普及[1]。中医治疗PMOP历史悠久，更能从整体上把握，从而辨证施治，拥有更广阔的前景。

PMOP主要是由于雌激素的撤退导致的骨量的减少、骨的脆性增加，其发病机制与成骨和破骨的不平衡密切相关，即成骨细胞的成骨分化能力减退，破骨细胞的活性增强[2]。因此，促进骨形成的同时抑制骨吸收仍然是目前防治PMOP的重点所在[3]。

《太平圣惠方》中的鹿角胶丸具有防治骨质疏松症的药理学作用[4]。方中鹿角胶平补肾气，杜仲、牛膝、菟丝子补益肾精，肉桂健补脾胃，滋养后天生化之源，熟地以养血，共起填精益气之功效，但鹿角胶丸对PMOP是否具有防治作用目前还没有研究。本研究旨在探讨鹿角胶丸对PMOP的防治效果及潜在机制，为临床应用中药防治PMOP提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：健康SPF 级雌性SD 大鼠80只，3个月月龄，体质量(300±10) g，购自辽宁长生生物技术有限公司[许可证号 SCXK(辽)2015-0001]。

1.1.2药物及试剂：(1)实验药物。中药复方鹿角胶丸均在辽宁中医药大学附属医院购买，组成：由鹿角胶3 g，附子10 g，肉桂5 g，杜仲10 g，山茱萸10 g，菟丝子12 g，熟地黄10 g，肉苁蓉10 g，五味子5 g，牛膝10 g，巴戟天5 g。将药制备为水煎剂，生药量为1 g/mL。仙灵骨葆胶囊(贵州同济堂制药，国药准字号：Z20025337)；福善美(阿仑膦酸钠，默沙东公司，进口药品注册证号H20130241)。(2)实验试剂。苏木素伊红(HE)染色试剂盒(碧云天公司，中国)；Human β-CTX ELISA检测试剂盒(PHICON Biotech公司，中国)；Human P1NP ELISA检测试剂盒(PHICON Biotech公司，中国)；SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德，武汉)；DAB 显色试剂盒(武汉博士德，武汉)；Runx 2(Abcom，美国)；Cathepsin K(Abcom，美国)。

1.1.3实验仪器：Micro CT(比利时，Bruker SkyScan 1174)；小动物辐照仪(美国，X-RAD 320)；显微镜(日本，OLYMPUS)；AMR-100酶标仪(中国，杭州奥盛仪器)。

1.2 方法

1.2.1动物分组、造模、给药：(1)分组。用电子天平先称量大鼠的体重范围，按随机数字表法分为8组，各组10只。A组：正常组(Control组)；B组：假手术组(Sham)；C组：模型空白组(去卵巢组，OVX组)；D组：中药复方组：高、中、低3个剂量组(鹿角胶丸组，LJJW-H、LJJW-M、LJJW-L 组)；E组：中药对照组(仙灵骨葆组，XLGB组)；F组：西药对照组(福善美组，FSM组)。(2)去卵巢大鼠模型(ovariectomized rat model，OVX)的建立、取血清及骨组织。动物的饲养、OVX模型的建立按照课题组前期的实验方法[5]。末次灌胃后，经24 h禁食，将大鼠麻醉成功后，逐步显露腹主动脉及其分叉，缓慢抽吸腹主动脉内血液注入采血管内，离心取上清液，分装1.5 mL EP管内，冻存备用。剔出双侧股骨，医用纱布包裹，外包锡纸，-70 ℃冰箱冻存，待测骨密度。(3)给药剂量与方法。大鼠等效剂量按成人用药量的6.3倍计算(成人体质量按70 kg计算)。给药容积：1 mL/100 g体质量。Control、Sham、OVX组给予等体积的0.9%氯化钠溶液；中药复方组予鹿角胶丸水煎剂；中药对照组用仙灵骨葆胶囊水溶液；西药对照组用福善美水溶液，调成1 g/mL的药物溶液。造模开始后给药，每日上午、下午各灌胃给药1次，连续9周。每周称大鼠体质量1次，根据其变化调整给药剂量。

1.2.2DEXA、Micro-CT、HE染色检测骨密度及骨结构：(1)使用DEXA骨密度检测仪及系统自带骨密度分析软件测定大鼠的全身、脊柱及下肢的BMD (g/cm2)；(2)将股骨标本置于10%福尔马林中固定24 h 后进行micro-CT 扫描。对所有扫描图片进行3D重建，并使用系统分析软件计算松质骨的骨体积分数(BV/TV)、结构模式指数(structural mode index，SMI)、骨小梁数量(Tb.N)及BMD(Tb.Sp)[6]；(3)骨组织脱钙、石蜡包埋、切片、脱蜡，苏木素染色液染色，伊红复染，二甲苯透明、中性树胶封片，常温晾干，显微镜下拍片并保存。

1.2.3ELISA法检测骨代谢指标：β-CTX、PINP试剂盒，放置恢复室温，按照说明书进行分组加样，37 ℃温育箱中避光、缓慢水平均匀摇晃、温浴60 min，孔内均加满洗涤液，放置30 min后弃掉。加试剂盒内A、B液，轻轻摇晃混匀显色，加入终止液50 μL，终止试剂反应。最后测定吸光度，450 nm波长测量吸光度(OD值)。绘制标准曲线的回归方程，计算出β-CTX、PINP的浓度。

1.2.4骨组织免疫组化、Western Blot测定相关蛋白表达：(1)骨组织切片脱蜡、抗原修复、血清封闭、一抗孵育过夜、二抗标记，DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，苏木素复染、固定封片及检测；(2)提取骨组织蛋白、上样、转膜、封闭、一抗孵育过夜、辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗孵育、ECL发光成像，Image J软件测定平均灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示，组间比较采用ANOVA方法，若满足正态分布，但不满足方差齐性条件，采用配对t检验；若数据不符合正态分布，采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 实验结果

2.1 大鼠BMD检测结果

双能X线检测各组大鼠的骨密度(图1 A)，结果显示，Control、Sham组的骨密度为(0.25±0.01) g/cm2、(0.26±0.01) g/cm2(Control组图中未显示)，OVX组骨密度为(0.18±0.01) g/cm2，鹿角胶丸低剂量组、中剂量组、高剂量组分别是(0.20±0.01) g/cm2、(0.23±0.02) g/cm2、(0.21±0.02) g/cm2(图中显示LJJW-M组)，XLGB组为(0.21±0.01) g/cm2，FSM组为(0.22±0.03) g/cm2(图中未显示)。相比于Sham组，OVX组大鼠的BMD明显降低(P<0.05)(图1B)。相对于OVX组，LJJW-H、LJJW-M、LJJW-L、XLGB、FSM组的骨密度均有改善，说明各个处理组均有提高绝经后大鼠骨密度的药理学作用，但作用效果不尽相同，其中以LJJW-M组的骨密度提高最明显(P<0.05)，其次是FSM组(P<0.05)，LJJW-H和XLGB组的提高骨密度的效果相似，LJJW-L的骨密度改善效果最差，结果提示鹿角胶丸具有提高去卵巢大鼠BMD的药效学作用。

图1 鹿角胶丸提高OVX大鼠的骨密度Fig.1 Improvement of bone mineral density in OVX rats with deer horn glue pill注：与OVX相比，※P<0.05；与Sham组相比，△P<0.05。

2.2 HE染色结果

HE染色检测各组骨组织结构的改变，Sham组大鼠骨小梁结构完整、无断裂，骨小梁形态排列紧密、所占骨面积的比例大，骨髓腔比例相对小(图2)。OVX组骨小梁形态破坏明显、出现明显断裂，骨小梁排列紊乱，髓腔空洞较多，骨小梁面积百分比(Tb.Ar%)明显下降(P<0.05，与Sham组比较)。相对于模型OVX组，LJJW-H、LJJW-M、LJJW-L、XLGB、FSM组骨小梁含量明显增多、增宽，骨小梁断裂明显减少，排列略整齐，髓腔减小。但是仍未有达到正常组及Sham组的标准。各药物处理组中以其中LJJW-M组表现尤为明显(P<0.05，与OVX组比较)。

图2 HE染色检测各组大鼠骨组织结构的改变Fig.2 HE staining to detect the changes of bone tissue structure in each group注：与OVX相比，※P<0.05；与Sham组相比，△P<0.05。

2.3 大鼠血清β-CTX、PINP含量的改变

2.3.1ELISA法测定大鼠血清中PINP含量：OVX组血清中PINP含量降低(P<0.05，与Sham组相比)，表明大鼠骨代谢处于骨形成抑制的状态(图3)。LJJW各处理组的PINP值都高于OVX组，尤其以LJJW-M组升高的最明显(P<0.01，与OVX组相比)。XLGB组亦能升高血清中PINP值(P<0.05，与OVX组相比)。FSM组对血清中的PINP值影响不明显。

图3 中药复方鹿角胶丸提高OVX大鼠的PINP值Fig.3 Improvement of PINP value in OVX rats with deer horn glue pill注：与OVX相比，※P<0.05；与Sham组相比，△P<0.05。

2.3.2ELISA法测定大鼠血清中β-CTX含量：与Sham组相比，OVX组血清中β-CTX含量升高(P<0.05)，LJJW各处理组的β-CTX值都低于Sham组(图4)。与OVX组相比，P<0.05。

图4 中药复方鹿角胶丸降低OVX大鼠的β-CTX值Fig.4 Reduction of β-CTX in OVX rats with deer horn glue pill注：与OVX相比，※P<0.05；与Sham组相比，△P<0.05。

2.4 Micro-CT检测结果

Micro-CT检测大鼠股骨结构的改变(图5)。与Sham组相比，OVX组股骨Micro CT 指标的BMD、BV/TV和Tb.N分别降低了68.08%、71.89%和61.54%，而SMI上升39. 34%。LJJW-M给药组明显改善骨小梁的情况，骨小梁的数量明显增多，破坏减少，相对于模型组来说，XLGB组的骨密度及骨小梁的情况也有所改善，但是改善的幅度及效果不如中药处理组。与OVX相比，BMD值LJJW-M组P<0.01，XLGB组P<0.05。Tb.N值LJJW-M组P<0.05，XLGB组P<0.05。

图5 中药复方鹿角胶丸改善骨结构Fig.5 Deer horn glue pill improves bone structure注：*：与OVX相比，LJJW-M组P<0.01，XLGB组P<0.05；△：与OVX相比，LJJW-M组P<0.05，XLGB组P<0.05。

2.5 Western blot 检测结果

2.5.1成骨相关蛋白Runx 2的表达：OVX大鼠予鹿角胶丸中药复方(LJJW-M)干预12周后，OVX组Runx 2的表达明显降低(P<0.05，与Sham组相比较)(图6)，而LJW-M处理组的Runx 2表达相对升高(P<0.05，与OVX组相比较)，但是没有恢复到对照组的水平，而XLGB组的Runx 2的表达与LJJW-M相似(P<0.05，与OVX组相比较)。

图6 中药复方鹿角胶丸促进Runx 2蛋白表达Fig.6 Promotion of the expression of Runx 2 protein with deer horn glue pill注：*：与OVX相比，LJJW-M组P<0.05，XLGB组P<0.05；△：与Sham相比，P<0.05。

2.5.2破骨相关蛋白Cathepsin K的表达：OVX大鼠予鹿角胶丸中药复方(LJJW-M)干预12周后，与Sham组相比，OVX组的Cathepsin K表达明显升高(P<0.01，与Sham组相比较)(图7)。而LJW-M处理组的表达相对减低(P<0.01，与OVX组相比较)，甚至低于普通的水平，而FSM组的Runx2的表达与LJJW-M相似(P<0.05，与OVX组相比较)。

图7 鹿角胶丸抑制Cathepsin K蛋白表达Fig.7 Prohibition of the expression of Cathepsin K protein with deer horn glue pill注：*：与OVX相比，LJJW-M组P<0.01，XLGB组P<0.05；△：与Sham相比，P<0.01。

2.6 免疫组化检测结果

免疫组织化学法进一步检测成骨相关通路蛋白Runx2的表达。结果显示，对照组松质内骨细胞内有一定的Runx 2的蛋白表达(棕色颗粒，箭头所示)(图8)。与Sham组比较，OVX组的Runx 2的蛋白表达明显减少，鹿角胶丸中药复方(LJJW-M)处理OVX大鼠一定时间(12周)后，Runx2的表达相对增多(P<0.01，与OVX组相比较)，但是没有恢复到对照组的水平，而XLGB组的Runx2的表达亦增加，但表达低于LJJW-M处理组(P<0.05，与OVX组相比较)。

图8 鹿角胶丸促进Runx 2蛋白表达Fig.8 Promotion of the expression of Runx 2 protein with deer horn glue pill注：与OVX相比，*P<0.01；与OVX相比，△P<0.05。

3 讨论

PMOP主要是由于雌激素的撤退导致的骨量的减少、骨的脆性增加、骨折风险性增加的一种疾病，随着人口的老龄化，该病的发病率及致残致死率也在逐年提升[1-2]。

《黄帝内经》中记载：“肾者，主骨生髓”“肾主藏精”，补肾填精仍是治疗PMOP的主要治则。研究发现，在应用鹿角胶丸对骨质疏松模型大鼠干预的研究中，与对照组相比较鹿角胶丸能够明显增加骨密度，促进骨形成，抑制抑制骨吸收[4]。鹿角粉制成的颗粒具有补钙，温肾阳，强筋骨等功效[7]。

本研究对鹿角胶丸防治PMOP的药理学作用及其潜在机制进行进一步研究发现，鹿角胶丸能够提OVX大鼠骨密度，其中以LJJW-M组的骨密度提高最明显，结果提示鹿角胶丸具有提高去卵巢大鼠BMD的药效学作用。随后，应用Micro-CT、HE染色检测各组骨组织结构的改变，模型组骨小梁形态破坏明显、出现明显断裂，骨小梁排列紊乱，髓腔空洞较多。LJJW-M处理组骨小梁含量明显增多、增宽，骨小梁断裂明显减少，排列略整齐，髓腔减小，LJJW-M组提高OVX大鼠BMD、BV/TV 和Tb.N，降低SMI值，说明鹿角胶丸具有改善骨结构、增加骨强度的药理学作用。

PMOP发生的过程中，血清中的相关股形成及骨吸收的检测标记也随之发生改变[8]，LJJW各处理组的β-CTX值都低于Sham组，尤其以LJJW-M组降低的最明显，说明鹿角胶丸能够降低OVX大鼠血清中β-CTX水平、抑制骨吸收。模型组血清中PINP含量降低，LJJW各处理后PINP升高，说明LJJW能够提高血清中PINP、促进骨形成。

Runx 2是骨形成重要的通路调节蛋白[9]，OVX组的Runx2表达明显降低，而LJW-M处理组的Runx 2表达相对升高，但是没有恢复到正常水平。Cathepsin K是破骨细胞吸收活性的重要调节蛋白[10], Cathepsin K的表达在OVX组明显升高，而LJW-M能够抑制其表达，甚至低于对照水平。说明鹿角胶丸可能通过对成骨及破骨的双重调节，进而达到防治PMOP的目的。

本研究从动物体内的角度探讨鹿角胶丸对PMOP的防治效果及潜在的作用机制，发现鹿角胶丸具有防治PMOP的药理学作用的同时，且可能通过调节成骨及破骨的双重作用完成的，本研究丰富了中医防治PMOP的科学内涵，并为该药应用于临床防治PMOP提供实验依据。