油性食品中脂溶性抗氧化剂快速检测方法的建立及研究

□ 李 亮 刘荣利 别蓓蓓 胡晓佳 赵依梵 陈甜甜 西安培华学院医学院

1 概述

1.1 研究背景

多年以来由于食品安全问题引发的重大事故数见不鲜，要想有效防止这些事故的发生就要严格管控食品质量以及添加剂的添加等，而目前国家食品安全监督管理体系大多需要依靠仪器分析，仪器分析虽然精确度得到了有效提高，但是检测周期较长，不能及时向有关部门反映。本研究研究出了一种快速并且高效的检测方法，适用于大批量样品的检测，从而快速检测出抗氧化剂（BHA、BHT）。目前国内外常见的检测方法有：比色法、薄层色谱法（TLC）、气相色谱法（GC）、液相色谱—质谱联用法等，以上4种检测方法需要的仪器比较昂贵，检测成本比较高，操作比较繁琐，而比色法操作虽然简单，但是精度还有待提高，液—质联用在我国还是并未普及[1]。

1.2 抗氧化剂性质及显色原理

BHA：化学名为叔丁基—4—羟基茴香醚（结构见图1），BHA 是一种良好的抗氧化剂。单一使用时最大添加量为0.2 g/kg[2]。BHT 与BHA 混合使用时，总量不可以大于0.2 g/kg；BHA在动物脂肪中的抗氧化性强于植物脂肪，对不饱和植物油的抗氧化能力比较弱。并且还有较强抗菌作用，可抑制黄曲霉生长和黄曲霉毒素的产生[3]。

BHT（2，6—二叔丁基对甲酚）俗称抗氧剂264，也称T501，结构见图2。BHT 作为中国油脂类食品抗氧化剂开始使用于1940 年，在果仁、精油、油脂食品中有很好的稳定性，它的抗氧化作用机理是通过自身发生反应而清除油脂类食品中的氧，属于氧清除剂。对热非常稳定，不与金属离子发生反应，抗氧化性良好。

图1 BHA（叔丁基茴香醚）

图2 BHT（2，6-二叔丁基对甲酚）

2 实验部分

2.1 主要试剂与器材

BHA（西安德源和仪器设备有限公司），BHT（西安德源和仪器设备有限公司），2，6—二氯醌—4—氯亚胺（阿拉丁生化科技股份有限公司），纳氏比色管，分析天平（上海舜宇恒平），旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），索氏提取器，石油醚（AR bp.30 ～63 ℃），无水乙醇（AR）、咸味花生标准品（搅碎备用）。

2.2 确定显色条件

配置氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙和硼砂的饱和无水乙醇溶液，标号备用。分别取等量BHA、BHT 与4支纳氏比色管，加入等量无水乙醇，振摇使之溶解，标号Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ[4]。对应加入缓冲溶液后振摇0.5 min，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四种溶液均不褪色，其稳定性效果较好。通过对显色结果的对比，得出氢氧化钠饱和乙醇溶液显色效果最佳。

2.3 实验操作

①配置氢氧化钠饱和无水乙醇缓冲溶液，取10 mL 无水乙醇于烧杯中，加入过量氢氧化钠，边加边搅拌，直至不溶。②配置2，6—二氯醌—4—氯亚胺显色剂，用分析天平称取固体2，6—二氯醌—4—氯亚胺3 g，溶于10 mL 无水乙醇中，作为显色剂；本显色剂为淡黄色，需在0 ～2 ℃中密封冷藏。③分别配置7 组待测标准液，浓度为0 ～0.05、0.05 ～0.1、0.1 ～0.15、0.15～0.2、0.2～0.25、0.25～0.3 g/mL与0.3 ～0.35 g/mL。每个区间配置5组。将已配置好的待测标准溶液分别取5 mL 于纳氏比色管，加入1 mL 饱和氢氧化钠，后其加入3滴显色剂（2，6—二氯醌—4— 氯亚胺），并记录显色颜色。

2.4 样品中BHA、BHT 提取

将买来的花生用粉碎机粉碎好后备用并编号，称取不同的备好的碎花生各2.0 g，用索氏提取器提取花生中脂肪，加入无水乙醇后加热回流30 ～60 min，至提取液近乎无色后停止加热。将回流的提取液用旋转蒸发仪蒸浓缩至5 mL 左右，标号作为待测溶液[5]。

BHA、BHT 的提取：把15 mL 甲醇分3 次加入含有脂肪残渣的平底烧瓶中，每次用移液管加入5 mL 甲醇，加入甲醇后漩涡震荡2 min，让脂肪残渣在甲醇中充分溶解，然后将其转入10 mL 离心管进行离心，离心时应以8 000 r/min 的速度进行10 min 的离心，离心取出后吸取全部上清液放置于50 mL 圆底烧瓶中，利用旋转蒸发仪将离心后上清液蒸干，量取5 mL甲醇于圆底烧瓶中，溶液通过0.45 μm有机微孔滤膜过滤，标号后，所得滤液可用于气相色谱分析。

2.5 气相色谱检测

GC—1120 气相色谱仪，氢火焰离子化检测器（FID），色谱柱型号为SE—30，50 m×0.32 mm×2.0 μm。色谱柱初始温度设为150 ℃，温度到 达2 min 后，以30 ℃/min 的 速度 升 到280 ℃， 升 至280 ℃后 保持30 min。进样口和检测器温度为280 ℃，流量：氢气40 mL/min，氮气120 mL/min，空气400 mL/min。进样量为1 μL，分流比1 ∶10[6]。

2.6 显色结果

取5 支纳氏比色管，分别加入2 mL5 种不同花生提取液并且标号，向每支试管中加入1 mL 氢氧化钠饱和乙醇溶液，振荡2 min 后，加入3滴2，6—二氯醌—4—氯亚胺无水乙醇溶液后振摇0.5 min，加入显色剂后瞬间显色且0.5 min 不褪色。对比5支不同花生显色结果与标准色阶可得出，2、3、5 号花生中不含有BHA、BHT 或 所 含BHA、BHT 含量 在0 ～0.05 g/mL，而1 号花生所含BHA、BHT 在0.15 ～0.20 g/mL，而4 号花生所含BHA、BHT在0.1～0.15 g/mL。通过与标准色阶对比，可得出此1 号、4 号花生含有BHA、BHT 且所含有量并未超过国家标准。因此以2，6—二氯醌—4—氯亚胺作为显色剂，可用于脂溶性抗氧化剂BHA、BHT 快速检测。

根据表1 可得，只有1 号和4 号花生检测出BHA、BHT，其中1 号花生中BHA、BHT 含量高于4 号花生，并且都小于标准含量，而2 号、3 号、5 号花生并未检测出BHA、BHT。

表1 不同花生中BHA 和BHT 含量测定结果及相对标准偏差

3 结果与分析

实验以2，6—二氯醌—4—氯亚胺作为快速检测的显色剂，以不同浓度标准品BHA、BHT 为待测液，对这7 个显色区间进行测定：0 ～0.05、0.05 ～0.、0.1 ～0.15、0.15 ～0.2、0.2 ～0.25、0.25 ～0.3 g/mL 与0.3 ～0.35 g/mL，其中0 ～0.5 g/mL由于含有BHA、BHT少，基本不显色（显色剂颜色淡黄色）。利用快速检测法测定5 种不同花生咸味花生中BHA、BHT，显色结果中1 号、2 号、3 号、4 号和5 号花生中的BHA、BHT 并未超过国家标准，而2 号、3 号、5 号花生中不含有BHA、BHT 或含量较少，1 号花生、4 号花生中的BHA、BHT 含量分别在0.15 ～0.20 g/mL、0.1 ～0.15 g/mL。经气相色谱法验证，1 号、4 号花生中BHA、BHT 并未超过国家标准，2 号、3 号、5 号花生并未检测出BHA、BHT，从而验证出快速检测法具有可靠性，2，6—二氯醌—4—氯亚胺可用于快速检测的显色剂。

4 结论

快速检测法作为新的检测方法样品处理（只需从花生中提取出BHA、BHT 混合溶液）、进行样品检测，快速检测操作相对简单，适用于大批量样品的检测，当其含量在0.2 ～0.25 g/mL 时，再用大型仪器进行检测，这样既可以减少检测所耗费时间，又可以更快速、更高效的得出检测结果。