α-NETA 在上皮性卵巢癌细胞中功能研究

乔联桥，吴晓梅，席晓薇

作者单位：上海市第一人民医院妇产科，上海 200080

卵巢恶性肿瘤是全世界女性生殖器官最常见的恶性肿瘤之一，有研究显示，化疗耐药是卵巢癌高死亡率的重要原因之一［1］。因此，寻找研发更加有效敏感的化疗药物，开发新的治疗手段，对广大卵巢癌病人有着深刻意义。

α-NETA（N，N，N-trimethyl-y-oxo-1-naphthalenepropanaminiumiodide）作为小分子化学药物，是一种乙酰胆碱转移酶抑制剂（Choline Acetyl Transferase，ChAT）（IC50＝9 µmol/L），一般用于神经细胞功能实验的实验室研究［2］，2017年有报道发现化疗药物与细胞凋亡之间存在相关关系［3］。研究发现其有发挥杀灭肿瘤细胞的新功能。β-arrestin2 是一类Arrestin家族成员，它不仅参与调节G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs）的脱敏和内化，还可以作为支架蛋白转导细胞信号通路［4-8］。有研究证实，β-arrestin 2 以及β-arrestin 1 具有抗细胞焦亡作用，同时β-arrestin 2 可以通过多种途径调节免疫反应，如抑制NF-KB 活化、调节趋化因子受体介导的免疫细胞趋化等，同时还与免疫系统疾病、炎症、肿瘤等相关［4-8］。本研究自 2015年 1月至 2016年1月研究α-NETA 在上皮性卵巢癌细胞中的功能。

1 材料与方法

1.1 材料 上皮性卵巢癌细胞株：HO8910 和Hey细胞株购买自美国ATCC 公司。Moody 从本实验室获取。裸鼠BALB/c 经上海市第一人民医院动物实验动物中心申请获取。细胞培养液采用DMEM（Dulbeccoo’s Modification of Eagle’s Medium Dulbecco）（购买于Gibco）加10%FBS 加1%双抗生素。抗体anti-β-arrestin2，anti-GAPDH，α-NETA 购买于Abcam公司。

1.2 CCK8（Cell Counting Kit-8） 培养皿中培养细胞至融合度约90%。胰酶消化细胞，配制细胞悬液，约2×104～2×105/mL 左右。在96 孔板中铺板，培养箱培养24 h。用DMEM空白培养基配制α-NETA 药物浓度梯度液（5，25，12.5，6.25 µg/mL），更换细胞培养液，加入药物浓度梯度液，每孔100 µL。将培养板在培养箱孵育24 h。向每孔加入10 µL CCK8溶液。将培养板在培养箱内孵育1～4 h。用酶标仪测定吸光度。

1.3 流式细胞死亡检测 配制细胞悬液六孔板铺板，保持细胞密度约70%，培养箱（37 ℃，5%二氧化碳）培养 24 h。根据 IC50（half maximal inhibitory concentration）使用空白 DMEM 稀释 α-NETA 母液，实验组三孔更换加入药物的空白培养液，使用空白培养基设立三孔对照组。培养箱内孵育24 h 后分别消化两组细胞配制细胞悬液。按表1 设计加入Annexin V 与核酸染料。轻轻混匀，室温避光放置15 min，1 h内上机操作检测。

记录相应数据后统计分析作图。

表1 流式细胞死亡检测过程中加入试剂名称

1.4 体内动物实验 取15 只雌性免疫缺陷裸鼠（BALB/c）用于异种移植研究。每5只小鼠圈养在一个笼子中，每天12 h 昼夜交换模式，可以随意获取食物和无菌水。将α-NETA 溶于99.5%甲醇（上海世益化学品有限公司），用Opti-MEM（Gibco 31985070，USA）配制溶液为12.5µg/mL。使用PBS配制HO8910 细胞悬液，每只小鼠在左腋窝皮下注射约1×107HO8910 细胞。每日称重小鼠并每隔一天测量肿瘤。肿瘤体积计算：瘤体积（mL）＝长×（宽）2×0.5。2周后，将15只小鼠随机分成三组，（对照组，实验组1 和实验组2）。当肿瘤达到≥0.15 mL的体积时，用药物治疗小鼠。实验组1（n＝5）每只小鼠每天注射50µLα-NETA工作溶液，对照组（n＝5）皮下注射与实验组相同浓度的载体液体。实验组2（n＝5）在1 周前以与对照组相同的方式进行治疗，并且在1 周后进行与实验组1 相同的治疗。根据伦理准则，当肿瘤达到2 mL体积或直径超过2 cm时，处死动物，然后切除肿瘤。将肿瘤在冰箱中于-80 ℃冷冻。密切监测小鼠的体重减轻和其他毒性迹象。通过Kruskal-Wallis检验将三组的统计学（肿瘤体积，肿瘤重量和小鼠体质量）用于比较分析。

1.5 统计学方法 使用SPSS 和GraphPad Prism 软件进行统计分析和制作图表。数据采用表示。两组间比较采用t检验。多组间比较采用Kruskal-Wallis检验。P＜0.05被认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 α-NETA 诱导上皮性卵巢癌细胞死亡 图1A所示为100 倍显微镜下杀灭效果。使用CCK8 对HO8910，Hey 和正常卵巢细胞株Moody 细胞系进行细胞毒性测定（图1B）。同时，进行IC50 计算：HO8910＝6.28 µg/mL，Hey＝26.34 µg/mL，Moody＝45.29 µg/mL（1 µm α-NETA＝369.24 mg；1 mg α-NETA＝0.27 µmol）。用浓度为12.5 µg/mL α-NETA 的空白培养基处理HO8910 24 h（与对照相同浓度的甲醇），并使用流式细胞仪进行死亡率测定（图1C）。α-NETA 组的死亡率46.8%远高于对照组的2.8%。所有实验进行了3次以上的独立重复实验。

2.2 α-NETA 可抑制体内肿瘤生长 在免疫缺陷小鼠BALB/c 异种移植模型中检测α-NETA 在体内作用效果。HO8910细胞用于皮下肿瘤形成。通过瘤内注射方式给药。图2A 为动物实验周期图。图2B示，与对照组相比，实验组1（治疗1周）和实验组2（治疗2 周）的肿瘤体积（P＝0.007）和肿瘤重量（P＝0.004）都有所减少。Kruskal-Wallis 检验三组间比较，P＜0.01。α-NETA 使用浓度未观察到小鼠中毒或者死亡现象。

图1 α-NETA细胞学药物毒性检测：A为100倍显微镜下浓度12.5µg/mL α-NETA作用HO8910细胞24 h后实验组与对照组效果图，B为对HO8910，Hey卵巢癌细胞株以及正常卵巢细胞株Moody进行CCK8毒性检测，C为流式细胞仪进行死亡率测定

2.3 α-NETA 通过β-arrestin 2 介导杀死肿瘤细胞 将α-NETA 处理后的HO8910 细胞与对照组细胞进行WB 检测，结果发现处理组HO8910 细胞βarrestin 2 表达增加（图3A）。同样检测CMKLR1 的表达情况，结果差异无统计学意义（数据未展示）。这表明β-arrestin 2作为一个与细胞膜表面的G蛋白偶联受体CMKLR1 密切相关的蛋白参与了杀死肿瘤细胞的过程。同时，根据之前化疗药物与细胞焦亡相关的报道［3］，对α-NETA 处理后的上皮性卵巢癌细胞HO8910 进行显微镜下观察，发现产生有细胞焦亡相关的特征性大泡（图3B）。

3 讨论

本研究的开端起源于一个偶然的发现。α-NETA 是CMKLR1的一个新型抑制剂可以通过调节βarrestin2 抑制 CMKLR1 活性［2］。起初我们推测，CMKLR1被α-NETA处理后会可能会抑制上皮性卵巢癌细胞迁移，于是我们进行了细胞划痕实验，但是我们发现用α-NETA 处理卵巢癌细胞后，发现细胞停止生长，甚至死亡。经过反复实验验证之后，发现这并非一个偶然现象。

图2 α-NETA体内动物实验：A为体内实验周期图表。B为小鼠肿瘤离体照片，从上到下分别为对照组，治疗组1（Treated/1 week），治疗组2（Treated/2 week）。C为三组肿瘤体积的统计分析（P＝0.007）。D为三组肿瘤质量的统计分析（P＝0.004）。Kruskal-Wallis检验三组间比较，aP＜0.01

图3 α-NETA杀灭肿瘤细胞相关通路探究：A为对α-NETA处理后细胞蛋白进行3次独立重复WB检测结果发现处理组HO8910细胞较对照组β-arrestin 2表达增加，aP＜0.05，B为显微镜下200倍镜像观察，可见α-NETA处理组中有与细胞焦亡相关特征性大泡产生，见图a，b，c右下角所示。对照组无相关现象（见图d）

随后，我们进行了体内动物实验，发现了特定浓度下α-NETA的抗肿瘤作用。但是对于每一个小分子化疗药物，不可避免地一个问题就是药物的副作用表现，即毒性表现。我们通过小鼠活动力，体重等指标观察发现，与对照组相比，α-NETA治疗后的小鼠体重上升不明显，而且实验组小鼠有弓背表现，虽然并未发现影响小鼠活力，但是我们推测α-NETA 还是存在一定的毒性或者是神经性毒副作用。但是这并不能否定α-NETA作为一个新型抗肿瘤小分子化学药物的可能性。

更进一步地，我们在细胞死亡通路研究检测中发现了β-arrestin2 的差异表达，在之前文献报道中有提及，α-NETA可以通过调节β-arrestin2在细胞膜内富集与CMKLR1细胞膜内羧基末端结合，从而导致CMKLR1，G蛋白偶联受体的失活。α-NETA在此过程中扮演了G 蛋白偶联受体的配体，替代chemerin 与其产生竞争与CMKLR1 结合发挥作用。该细胞通路被此前文献证明确实是存在的［9］，但是该通路的作用仅仅是被证明是抑制肿瘤细胞迁移，抑制肿瘤细胞增殖的作用。总之，本课题研究发现了β-arrestin2 可能参与了细胞死亡，之前有文献报道过Arrestin家族蛋白参与抑制细胞凋亡［4-8］。但同时也有文献报道化疗药物所致细胞死亡属于细胞焦亡［3］。所以，本课题要完全确定α-NETA 介导细胞死亡是哪种细胞死亡方式，还需要后续深入研究。但是，α-NETA作为小分子化学药物，其发挥的抗肿瘤细胞的新功能，是具有一定的临床意义与研究价值的。