野菊花精油化学成分分析及其抑菌活性*

张知侠，高奕红

(咸阳师范学院 化学与化工学院,陕西 咸阳 712000)

野菊花为多年生草本植物,多生长于路边、山坡草地、荒野以及小树林等野生地带,为菊科菊属植物野菊(ChrysanthemumindicumLamb)的干燥头状花序。野菊花是一味中药，其全草皆可入药，在中国各地均有分布，盛产于云南、四川等地区；野菊花性苦、辛凉，主要用于治疗肿毒疮痈，疏风散热，多用于上呼吸道感染、流行性感冒的治疗，还有降血压，泻火平肝等作用。野菊花的生物活性多样，其成分中以精油、黄酮类、多糖、二萜类为主；现代药理研究表明，野菊花提取物有较强的抗氧化能力、抗骨质疏松[1-2]，可降血糖、降血脂[3-4]，镇痛消炎[5-7],还具有一定的抗抑郁作用[8-9]，在抗癌方面的研究也有新进展，野菊花提取物具有抗前列腺癌[10]，抗肝癌的作用[11]；其精油具有广谱抗菌活性，能有效抑制白色念球菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、白喉杆菌及大肠杆菌等细菌[12]。在植物保护方面的应用研究发现野菊花精油对植物病原菌烟草黑胫病菌[13]、荞麦立枯丝核菌都表现出较强的抑制活性[14]。实验对产自陕西咸阳本地的野菊花精油的化学成分及其抑菌活性进行研究，以期为有效开发野菊花资源，充分挖掘野菊花精油作为农药的有效成分，为开发天然产物农药提供理论依据。

1 实验部分

1.1 原料、试剂与仪器

野菊花：采于陕西咸阳郊区山坡上，用其头状花序，经筛选干燥后粉碎过450 μm筛，置于-18 ℃冰箱中保存备用；辣椒疫霉病菌、番茄叶霉病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、水稻稻瘟病菌、黄瓜炭疽病菌、小麦纹枯病菌、苹果炭疽病菌、棉花立枯病菌、玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌：西北农林科技大学无公害农药研究服务中心提供；培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。

氯化钠、石油醚、无水硫酸钠：分析纯，天津市河东区红岩试剂厂；丙酮：济南汇丰达化工有限公司。

气相色谱-质谱联用仪：GC-MS/QP2010，日本岛津公司；智能型生化培养箱：SPX-150B，上海琅玕实验设备有限公司；全自动蒸汽灭菌锅：D-1，上海乔跃电子科技有限公司；旋转蒸发仪：R213，上海申生科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 野菊花精油提取

将在咸阳郊区采摘的新鲜野菊花进行筛选放入50 ℃烘箱烘干，t≈3 h，然后粉碎过450 μm筛。准确称量45 g，置于1 000 mL圆底蒸馏烧瓶中，加500 mL蒸馏水浸泡4 h，按中华人民共和国药典(2010年版)精油提取方法[15]连续蒸馏7.5 h。将所得馏出液用氯化钠进行饱和，静置一段时间后，将饱和的提取液用石油醚萃取其精油，反复萃取3次，分出醚层，然后把萃取液合并再加无水硫酸钠干燥6 h,用旋转蒸发仪浓缩干燥后的萃取液,用丙酮作溶剂，收集获得野菊花精油0.372 g。

1.2.2 GC-MS分析

气相色谱条件为岛津CBP5-M25-025弹性石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为高纯氦气；柱流量1 mL/min,进样量1 μL，柱初温50 ℃,保温2 min,以5 ℃/min升温速率升至240 ℃,保留温度5 min；进样口温度230 ℃;柱前压55.5 kPa,分流比1∶50。

质谱条件为电子轰击离子源(EI),离子源温度200 ℃,电子能量70 eV,GC-MS接口温度220 ℃，电子倍增器电压0.97 V，溶剂峰切断时间2.0 min,质谱检测起测时间2.5 min。扫描模式为全扫描模式m/z，质量扫描范围29～350,质谱图计算机检索数据库：NIST 147。

1.2.3 抑菌活性测定

对选用的小麦纹枯病菌、辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌等11种病原菌，采用生长速率法[16]测试野菊花精油的抑菌活性。配制野菊花精油丙酮溶液，首先配制ρ(野菊花精油丙酮)=1 500 mg/L溶液的母液，然后将该溶液稀释配成ρ(野菊花精油丙酮)=1 000、750、500、250 mg/L的系列溶液后分别加入到配置好的PDA培养基中,置于培养皿，制成系列培养基平面,在该平面上对供试的11种病原菌分别进行接种,接种完成后轻置于已经设定好温度的生化培养箱，在26 ℃的培养箱中培养72 h，取出后，分别用卡尺采用十字交叉法测量各供试病原菌其菌落生长直径3次,取其平均值。根据公式(1)和公式(2)计算菌丝生长抑制率。

菌落生长直径=2次直径平均值-4.0(菌饼直径)

(1)

菌丝生长抑制率=(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100%

(2)

2 结果与讨论

2.1 精油收率

用水蒸气蒸馏法对采自陕西咸阳郊区山坡的野菊花进行精油提取，得到的野菊花精油为淡黄色有辛香味的油状液体，计算出精油的产率为0.827%。

2.2 精油化学成分的GC-MS分析

按前述的实验方法及条件,对野菊花精油的化学成分用GC-MS联用仪进行分析,得到总离子流图，见图1。

t/min图1 野菊花精油总离子流图

对总离子流图中各个化合物质谱图谱应用SHIMADZU GCMSsolution Release 2.10专业分析软件，NIST147数据库进行检索,比较其质荷比、基峰和相对丰度，结合解析相关图谱，按峰面积归一法计算确定各组成化合物的相对含量；通过与标准谱图对照、分析,确定出的野菊花精油的成分有43种,占总馏出峰面积的88.36%，见表1。

表1 野菊花精油化学成分

续表

由表1可知，其成分相对含量最高的是2-甲基二十烷，其次是左旋樟脑、桉油醇、十八烷、8-己基十五烷、反式-α-香柠檬烯。还含有少量其他的烃类、醇类、酯类、酸类、烯类等。

2.3 野菊花精油抑菌活性测试

野菊花精油用生长速率法对供试的11种病原菌进行测试，实验结果见表2。

由表2可知，野菊花精油对供试的11种病原菌抑菌作用都有差异，在提供的剂量下大多与ρ(野菊花精油丙酮)呈正相关。其对小麦纹枯病菌的抑制率最强，其系列ρ(野菊花精油丙酮)对应的抑制率达到95%，对番茄叶霉病菌、玉米大斑病菌的抑制率高于80%，仅次于小麦纹枯病菌；对黄瓜炭疽病菌、番茄早疫病菌稍低一些，而对辣椒疫霉病菌和小麦赤霉病菌的抑菌率在不同ρ(野菊花精油丙酮)时几乎不变，对其他几种病菌也有相对较低的抑制率。

表2 野菊花精油对11种病原菌的抑制率

3 结 论

利用水蒸气蒸馏法提取野菊花精油。通过GC-MS联用仪对其精油进行化学成分分析，鉴定出43种成分，占总馏出峰面积的88.36%。检测得到野菊花精油化学成分相对含量最高为2-甲基二十烷，其次为左旋樟脑、桉油醇、十八烷、8-己基十五烷、反式-α-香柠檬烯。还含有少量其他的烃类、醇类、酯类、酸类、烯类等。研究与何小珍[17]和Jing Chang-Liang[18]等对野菊花成分研究的结果有较大的差异，其主要原因是野菊花品种的多样性以及不同的提取方法、产地、气候、土壤等因素都有一定关系。同时，该实验用野菊花精油对供试的11种病原菌的抑菌实验测定表明，其精油对小麦纹枯病菌的抑制率最强，抑制率达到95%，对番茄叶霉病菌、玉米大斑病菌的抑制率高于80%，对其他的病原菌都有不同程度的抑制率。这和前期刘晓丹[19]等研究的野菊茎叶挥发油对植物病原真菌抑制作用强度略有不同，其原因与野菊的部位、产地等不同有关。由此可见，野菊花精油含有重要的抑菌活性成分，希望在继续的研究中分离这些活性成分,并进一步做抑菌实验，有可能发现具有新型杀菌活性的先导化合物，为新型抑菌农药的创制奠定良好的基础。