苯硼酸功能化纳米金的合成及其对沙丁胺醇的可视化检测*

2020-11-21 08:55贺茂芳胡娅琪唐一梅

化工科技 2020年5期

贺茂芳，秦蓓，张博，胡娅琪，唐一梅，周慧

(1.西安医学院药学院，陕西西安 710021；2.西安医学院药物研究所，陕西西安 710021)

沙丁胺醇(Salbutamol，SAL)是一种人工合成的选择性β-受体激动剂，可以促进动物体内蛋白质的沉积和脂肪的分解，明显加快和提高饲料转化率，提高酮体的瘦肉率，因此被用作畜禽的促生长剂和饲料添加剂[1]。SAL易在人和动物的内脏、器官中残留，严重危害人类的健康[2]。因此，高效、实用的检测方法对于畜产品安全有着重要意义。目前，SAL的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3-4]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[5-6]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[7]、电泳法(CE)[8-9]，免疫分析法[10-11]等。然而，这些方法仪器昂贵，操作复杂，不易推广普及。

与仪器分析法相比，基于纳米金颗粒(Au NPs)的可视化检测操作简便、结果直观，广泛应用于生物、环境和食品分析。Au NPs可视化检测的原理为单分散的Au NPs在溶液中呈现酒红色，当加入被检测物时，Au NPs表面的功能基团与被检测物发生反应，引起交联聚集，从而使颗粒间的等离子体耦合发生改变，吸收峰发生红移，溶液的颜色由红色变为紫色或蓝色[12]。基于Au NPs的可视化检测不依赖大型仪器，溶液颜色变化即可作为读出信号，信号检出速度较快，成本低廉，适合于现场检测和不具备大型仪器的场所[13]。

根据硼亲和原理，硼酸基在碱性条件下可与1,2-二羟基和1,3-二羟基结合，形成五元或六元环酯，从而实现对顺式二羟基化合物的特异性识别[14]。SAL分子中含有1,3-二羟基和氨基，因此，作者首先以柠檬酸三钠为稳定剂和还原剂制备Au NPs，然后将苯硼酸修饰于Au NPs表面。由于苯硼酸与1,3-二羟基特异性结合，同时，Au NPs表面的羧基与氨基通过静电吸引力结合，从而拉近Au NPs颗粒之间的距离，引起交联聚集，Au NPs溶液的颜色由酒红色转变为蓝色，从而实现对SAL的可视化检测。该方法简便快捷，成本低廉，为SAL的检测提供了新方法。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

四水合氯金酸：质量分数99%，3-氨基苯硼酸：质量分数98%，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)：质量分数99%，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)：质量分数99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；SAL标准品：质量分数99%，上海三爱思试剂有限公司；4-巯基苯硼酸：质量分数98%，北京百灵威科技有限公司；柠檬酸三钠：分析纯，国药化学试剂有限公司。

电子天平：CPA225D，pH计：PB-10，赛多利斯科学仪器有限公司；集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S，郑州长城科工贸有限公司；紫外可见分光光度计：Cary-60，安捷伦科技有限公司；透析袋：HT1134-5，Yobios生物科技有限公司；透射电镜：H-7650，日立科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 苯硼酸功能化纳米金(Au@PBA)的制备

1.2.1.1 Au NPs的制备

参照文献[15]，向圆底烧瓶中加入10 mL超纯水、92 μLc(氯金酸)=97 mmol/L的溶液，加热煮沸后，在磁力搅拌下迅速加入1.0 mLc(柠檬酸三钠)=38.8 mmol/L的溶液，继续加热搅拌10 min，可观察到溶液颜色由淡黄色逐渐转变为灰色，最终变为酒红色；停止加热，待溶液冷却后转移至透析袋中用水透析6 h，将得到的Au NPs溶液于4 ℃下避光保存备用。

1.2.1.2 EDC/NHS偶联法合成Au@PBA

将3.32 mg 3-氨基苯硼酸、2.3 mg NHS溶解于2 mL醋酸-醋酸钠缓冲液(pH=5.6)中，再加入3.83 mg EDC，45 ℃下反应1 h后，加入10 mL上述Au NPs溶液，调节溶液至pH=7.4，室温下搅拌反应6 h，将反应液用水透析，直至水中无3-氨基苯硼酸的紫外吸收峰。

1.2.1.3 静电自组装法合成Au@PBA

取10 mL Au NPs溶液于小烧杯中，加入0.5 mg 3-氨基苯硼酸，室温搅拌反应6 h，将反应液转移至透析袋中用水透析，直至水中无3-氨基苯硼酸的紫外吸收峰。

1.2.1.4 配位共价键法合成Au@PBA

取10 mL Au NPs溶液于小烧杯中，用c(NaOH)=0.5 mol/L的溶液调节至pH≈11.0，搅拌下缓慢加入100 μLc(4-巯基苯硼酸)=0.1 mmol/L的溶液，室温下搅拌反应12 h；将反应液转移至透析袋中用水透析，直至水中无4-巯基苯硼酸的紫外吸收峰。

1.2.2 标准溶液的配制

称取0.001 0 g SAL于10 mL容量瓶中，加入c(NH3-NH4Cl)=20 mmol/L缓冲液(pH=8.5)溶解，得到储备液。使用时，用缓冲液稀释至所需浓度即可。

1.2.3 检测方法

将制备好的Au@PBA溶液用NH3-NH4Cl缓冲液(pH=8.5)稀释10倍，取该溶液900 μL于2 mL离心管中，加入100 μL SAL标准溶液，反应10 min后扫描溶液的吸收光谱，对比SAL加入前后溶液最大吸收波长的变化。

1.2.4 Au@PBA用量的选择

量取100、200、300 μLρ(SAL)=1.5 μg/mL的标准溶液，分别加入到900、800、700 μLAu@PBA溶液中，10 min后扫描溶液的吸收光谱，计算650与530 nm处吸光度的比值(A650/A530)。改变ρ(SAL)=1.0、0.50 μg/mL，方法同上。对比3种ρ(SAL)下A650/A530值，确定Au@PBA的最佳用量。

1.2.5 标准曲线

取900 μL Au@PBA于2 mL的离心管中，分别加入100 μLρ(SAL)=0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 μg/mL的标准溶液(平行5份)，反应10 min后，扫描溶液的吸收光谱，计算A650/A530，以A650/A530为纵坐标，ρ(SAL)为横坐标作图。

2 结果与讨论

2.1 Au@PBA的合成与表征

首先，以柠檬酸三钠为还原剂和稳定剂，合成了Au NPs；然后采用3种不同的方法向Au NPs表面修饰苯硼酸，得到Au@PBA。在EDC/NHS偶联法中，Au NPs表面的羧基和3-氨基苯硼酸形成酰胺键；自组装法的原理是Au NPs表面的羧基与3-氨基苯硼酸通过静电吸引力结合；配位共价键法的原理是4-巯基苯硼酸与Au NPs形成金属配位键。通过比较这3种方法所得Au@PBA的稳定性，选择最佳合成方案。

经过多次的实验发现，配位共价键法合成的Au@PBA溶液放置1 d后由酒红色变为灰蓝色，说明其性质极不稳定，发生了团聚。

EDC/NHS偶联法和静电自组装法合成Au@PBA的紫外可见吸收光谱图见图1。

λ/nma EDC/NHS偶联法

λ/nmb 静电自组装法图1 EDC/NHS偶联法和静电自组装法合成Au@PBA的紫外可见吸收光谱图

由图1可知，EDC/NHS偶联法合成的Au@PBA相比于Au NPs发生了明显的红移，其最大吸收波长为610 nm，说明Au@PBA性质不稳定，发生了轻微的团聚；通过静电自组装法合成的Au@PBA的最大吸收波长为535 nm，相比于Au NPs几乎没有变化，这说明Au@PBA的性质稳定，基本没有发生团聚。

Au NPs和静电自组装法合成的Au@PBA透射电镜图见图2。

由图2可知，静电自组装前的Au NPs粒径约为15 nm，且分散性好、粒径均匀；经过3-氨基苯硼酸修饰后，Au@PBA仍然分散良好、未发生团聚，这与紫外吸收光谱的结果一致。因此，选择静电自组装法合成的Au@PBA进行SAL的检测。