紫檀芪对博来霉素诱导的肺纤维化大鼠上皮间质转化的影响

彭艳芳 张莹雯 张亚兵

摘要 目的：观察紫檀芪（Pterostilbene，PTE）对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化进程中上皮间质轉化（EMT）的抑制作用及其可能机制。方法：选取40只SD大鼠随机分为4组，分别为正常组、模型组、紫檀芪组及泼尼松组。除正常组外，其余组采用气管内注射博来霉素溶液制备大鼠肺纤维化模型。紫檀芪组给予30 mg/（kg·d）紫檀芪溶液灌胃，泼尼松组给予3 mg/（kg·d）泼尼松溶液灌胃，正常组和模型组予以等量DMSO溶剂灌胃，连续21 d。取肺组织行天狼猩红染色观察大鼠肺组织中Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）的分布情况;免疫组化和PCR检测大鼠肺组织α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、上皮细胞钙连蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）的表达。结果：与正常组比较，模型组Col-Ⅰ、Col-Ⅲ的分布均增多，Vimentin、α-SMA蛋白和mRNA的表达升高，E-cadherin蛋白和mRNA的表达下降。与模型组比较，药物组Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布均减少，同时上调E-cadherin的mRNA及蛋白表达水平，抑制α-SMA、Vimentin的mRNA及蛋白表达水平。结论：紫檀芪能有效缓解肺纤维化大鼠的纤维化进程，其机制可能与抑制胶原形成以及调控EMT相关分子的表达有关。

关键词 紫檀芪;Ⅰ、Ⅲ型胶原;肺纤维化;上皮间质转化;细胞外基质

Abstract Objective：To observe the inhibitory effects of Pterostilbene（PTE）on Epithelial-to-mesenchymal transition（EMT）in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats and its possible mechanism.Methods：A total of 40 SD rats were randomly divided into 4 groups：a normal group，a model group，a PTE group and a prednisone group.Except for the normal group，the rat pulmonary fibrosis model was prepared by intratracheal injection of bleomycin solution.30 mg/（kg·d）of PTE was given to the PTE group，3 mg/（kg·d）of prednisone was given to the prednisone group，and the normal group and the model group were given the same amount of DMSO for 21 days.Take the lung tissue and stain it with Sirius scarlet to observe the distribution of collagen type Ⅰ（Collagen Ⅰ）and collagen type Ⅲ（Collagen Ⅲ）in rat lung tissue.Immunohistochemistry and PCR detected the expression of a-SMA，E-cadherin and Vimentin in rat lung.Results：Compared with normal group，the distribution of Col-Ⅰand Col-Ⅲ in the model group were increasing.Vimentin，a-SMA higher protein and mRNA expression were rising.The expression of E-cadherin protein and mRNA decreased.Compared with the model group，the distribution of type Ⅰ and type Ⅲ collagen in the drug group was reduced，and at the same time the mRNA of E-cadherin and protein expression levels were up-regulated，and the mRNA of α-SMA、Vimentin and protein expression level were inhibited.Conclusion：PTE can effectively alleviate the fibrosis process of pulmonary fibrosis rats.The mechanism may be related to the inhibition of collagen formation and the regulation of the expression of EMT-related molecules.

Keywords Pterostilbene; Type Ⅰ and Ⅲ collagen; Pulmonary fibrosis; Epithelial-mesenchymal transition; Extracellular matrix

中图分类号：R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.18.004

肺纤维化（Pulmonary Fibrosis，PF）是由多种因素导致的慢性进行性间质性肺部疾病，病理表现以成纤维细胞增殖、大量细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）增生并伴炎性损伤、胶原沉积、肺组织结构破坏及重构等为特征，临床表现为活动性呼吸困难、限制性通气功能障碍、低氧血症等，最终发展为呼吸循环衰竭而死亡，严重危害人类身体健康[1]。吸烟、病毒感染、环境污染、遗传易感性和药物等为常见病因，随着人口老龄化加剧，加上空气污染日益严重，其患病率和发病率不断上升，尽管近年来我们对PF发病机制的认识和治疗有了一定的进展，但目前尚没有特效药物来治疗肺纤维化。研究发现，在肺纤维化患者及博来霉素引起的鼠肺纤维化模型中均发现上皮细胞损伤后的修复过程中伴有上皮间质转化（Epithelial-to-mesenchymal Transition，EMT），EMT是肺纤维化的关键过程。肺泡上皮细胞在炎性反应、氧化应激以及某些细胞因子等刺激下逐渐失去紧密连接，向间充质细胞转变，成纤维细胞、肌成纤维细胞积累，细胞外基质分泌增多，则发生EMT[2]，是肌成纤维细胞的重要来源，在EMT的过程中有许多通路和细胞因子参与。EMT过程被启动，产生大量的细胞外基质（ECM），从而分泌大分子的复杂网络，例如胶原蛋白、酶等，维持器官发育，而ECM过度沉积或失调会出现病理修复，正常的肺组织结构反复破坏，进一步导致EMT持续发生，最终出现组织器官的纤维化[3]，因此EMT在肺纤维化形成中起关键作用。

随着对PF研究的深入，中医中药表现出突出的的特点和优势。肺纤维化患者需长期服药，所以开發低毒、不良反应少、能够长期服用的抗EMT药物是肺纤维化药物研发的方向。紫檀芪是中药龙血竭的有效组成成分及存在于紫檀、葡萄、蓝莓等植物的生物活性成分，具有预防氧化应激反应、抗肿瘤、抗炎、抗纤维化等作用，是白藜芦醇的甲基化衍生物，且具有更高的生物利用度。Gu TT等[4]研究发现，紫檀芪可延缓果糖诱导的肾纤维化大鼠肾脏纤维化的进展，具有抗纤维化作用。本实验室前期研究证实了紫檀芪明显抑制博来霉素诱导的大鼠肺纤维化[5]，但其具体的作用机制目前尚不明确。目前肺纤维化的发病机制典型特征是ECM的过度沉积以及EMT，在EMT过程中有很多因子会发生改变，其中细胞外基质中主要成分Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原过度蓄积，间充质标志物如α-SMA、Vimentin等的表达水平上调，α-SMA是肺纤维化过程中肌成纤维细胞的表型标志，E-cadherin表达丢失是EMT最显著的特征[6-7]。本实验旨在研究紫檀芪对肺纤维化大鼠的影响及通过紫檀芪作用下EMT目的蛋白E-cadherin、ECM标志蛋白α-SMA、Vimentin、Col-I等的调节变化来推测紫檀芪在肺纤维化中的可能作用，意在为紫檀芪治疗肺纤维化提供新思路。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 选取健康雄性 SD大鼠40只，SPF级，体质量（200±20）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司;动物许可证号SCXK（京）2016-0006。饲养于武汉大学医学院动物房，适应性喂养1周。

1.1.2 药物 紫檀芪（PET，上海哈灵生物科技有限公司），纯度>99%，相对分子质量为256.30，分子式C16H16O3），常温、避光保存，溶于DMSO中。对照药物：泼尼松片（浙江仙居制药股份有限公司，国药准字H33021207），5 mg/片。

1.1.3 试剂与仪器 博来霉素（日本化药株式会社，货号：H20055883）;BSA（牛血清白蛋白）（Roche公司，型号：10735078001）;DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司，型号：ZLI-9033）;Vimentin一抗（Abcam公司，货号：ab20346）;α-SMA一抗（博士德公司，货号：BM0002）;E-Cadherin一抗（Servicebio公司，货号：GB12082）;天狼猩红染液（ASPEN公司，货号：AS1067）;中性树胶（国药集团化学试剂有限公司，货号：10004160）;TRIpure Total RNA Extraction Reagent（ELK Biotechnology公司，货号：EP013）;PCR仪（杭州博日科技公司，型号：TC-XP）;荧光定量PCR仪（Life technologies公司，型号：StepOneTM Real-Time PCR System）;倒置显微镜（OLYMPUS公司，型号：IX51）;成像系统（Q-IMAGING公司，型号：MicroPublisher）;病理切片机（上海徕卡仪器有限公司，型号：RM2016）。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 将大鼠随机分为正常组（A组）、模型组（B组）及泼尼松组（C组）、紫檀芪组（D组），每组10只，所有大鼠适应性喂养1周。除正常组外，其余3组大鼠参照Szapie等[8]经典造模方法诱导PF大鼠模型：大鼠麻醉后仰卧固定于鼠台上，将鼠颈部皮肤消毒并逐层分离，用1 mL注射器经暴露的气管朝向心端穿刺，注入博来霉素生理盐水溶液0.2～0.3 mL诱导肺纤维化模型，注射完毕后立即将大鼠直立旋转30 s，尽量使药液向下流入肺内时能够均匀分布，然后切口局部缝合。正常组以相同方法滴入等体积生理盐水，待大鼠自然苏醒后自由进食和饮水。

1.2.2 给药方法 于造模后第2天开始进行灌胃给药，空白组和模型组DMSO溶剂灌胃10 mL/（kg·d），泼尼松组予以泼尼松混悬液3.0 mg/（kg·d），紫檀芪组予以紫檀芪30 mg/（kg·d）给药，连续3周。

1.2.3 天狼猩红染色检测大鼠肺组织胶原沉积 天狼猩红是一种阴离子强酸性染料，可与胶原分子特异性结合而染色，能显示组织中Ⅰ～Ⅳ型胶原，其染色是显示肺纤维化时胶原含量变化的一种理想且特异的方法[9]。石蜡切片常规脱蜡至水，将水洗过的切片入天狼猩红染液中浸染1 h，片子直接入纯乙醇分化脱水，二甲苯Ⅰ5 min-二甲苯Ⅱ5 min中脱水透明，中性树胶封片。

1.2.4 免疫组化检测大鼠肺组织Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白的表达 石蜡切片经二甲苯脱蜡、EDTA缓冲液中微波修复，置于3%过氧化氢溶液中，室温下避光孵育10 min，PBS冲洗，5% BSA封闭20 min去除BSA液，每张切片滴加含鼠α-SMA抗体（1∶400）、鼠E-cadherin抗体（1∶100）、鼠Vimentin抗体（1∶100）的一抗，4 ℃摇床孵育过夜，PBS冲洗，滴加相应种属的二抗（1∶200），37 ℃孵育50 min，PBS洗后加DAB溶液，显微镜控制显色，苏木素复染，脱水干燥，透明封固，使用显微镜拍照。

1.2.5 RT-PCR检测大鼠肺组织Vimentin、α-SMA、E-cadherin mRNA的表达 取大鼠右上肺组织20 mg，于1 mL预冷的TRIpure中充分研磨匀浆，倒入EP管中加入250 μL三氯甲烷10 min离心，严格按照超纯RNA提取试剂盒提取总RNA，配制qRT-PCR反应体系。见表1。第一链cDNA的合成采用EntiLinkTM1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒进行（ELK Biotechnology，EQ003），实时荧光定量PCR是在Life technologies公司的StepOneTM Real-Time PCR仪上完成，每个样品均作3个复孔，使用EnTurboTM SYBR Green PCR SuperMix试剂盒进行（ELK Biotechnology，EQ001）采用2-△△Ct法计算 mRNA表达量。见表1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件对研究数据进行统计分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 4组动物肺纤维化程度改变比较 胶原含量是确定肺纤维化是否发生及其严重程度的关键指标，天狼猩红染色是胶原较特异性的染色方法，可以在1张切片上同时显示出Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维及其相互间的关系。结果可见正常肺组织中除各级支气管和血管壁存在较多Ⅰ和Ⅲ型胶原之外，肺泡壁仅有少量胶原存在。模型组肺泡壁可见较多黄色或红色Ⅰ型胶原及绿色的Ⅲ型细纤维胶原沉积，Ⅰ型胶原纤维呈紧密排列，为黄色或红色的纤维，Ⅲ型胶原纤维呈疏网状，显示弱的双折光性，为绿色的细纤维，大鼠肺组织胶原的面积显著高于正常组（P<0.01）;经紫檀芪干预治疗后Ⅰ型与Ⅲ型胶原面积均较模型组下降（P<0.01）。见图1，表2。

2.2 4组动物采用免疫组化法检测Vimentin、α-SMA、E-cadherin蛋白表达的比较 α-SMA蛋白主要表达于气管周围，E-cadherin主要位于肺泡上皮，以棕黄色染色为阳性表达。与正常组比较，模型组肺泡周围α-SMA、Vimentin表达明显增加，肺组织E-cadherin表达明显下调（P<0.01）;与模型组比较，紫檀芪组和泼尼松组E-cadherin表达增加，α-SMA、Vimentin表达减少，紫檀芪可抑制模型组诱导的肺组织EMT。见图2，表3。

2.3 4组动物采用RT-PCR法检测Vimentin、α-SMA、E-cadherin结果比较 与正常组比较，模型组Vimentin、α-SMA mRNA水平显著增高，E-cadherin mRNA水平降低（P<0.01）;与模型组比较，紫檀芪处理组Vimentin、α-SMA mRNA水平显著降低，E-cadherin mRNA水平增高，差异有统计学意义（P<0.01）;但紫檀芪组和泼尼松组比较，差异无统计学意义（P>0.05），提示紫檀芪可以下调肺纤维化大鼠的Vimentin、α-SMA mRNA表达，上调E-cadherin mRNA表达。见图3。

3 讨论

目前中医文献中多把肺纤维化归类为肺痿、肺痹范畴，病机为正气亏虚，痰瘀阻络的虚实夹杂。《金匮要略·心典》曰：“盖肺为娇脏，热则气烁，故不用而痿;冷则气沮，故亦不用而痿也”。紫檀芪为中药龙血竭的有效组成成分，龙血竭有“活血之圣药”美誉（明·李时珍《本草纲目》卷34），具有活血、化瘀、止血、补血的功效。Nichols等[10]评估剑龙血竭中有效成分发现为紫檀芪>白藜芦醇>龙血素B>龙血素A。现代研究提示龙血竭和白藜芦醇等[11-12]可减缓肺纤维化进展，减轻PF大鼠肺组织纤维化程度。肺纤维化是以弥漫性肺间质改变为主要特征的肺疾病，其主要病理变化为成纤维细胞增殖分化和细胞外基质产生增多。紫檀芪是一种有效的抗炎抗氧化应激的天然药物，本炎性反应采用博来霉素诱导大鼠制备肺纤维化模型，从上皮间质标志蛋白α-SMA、Vimentin、E-cadherin蛋白和mRNA表达以及Ⅰ、Ⅲ型胶原的表达等影响入手，探讨紫檀芪抗肺纤维化作用于EMT的效应机制。

肺纤维化是多种原因引起慢性肺疾病的共同结局，肺纤维化的发病—般认为要经历损伤、炎性反应变化、生理修复3个阶段，首先是肺组织细胞受到内在或外界的生物、化学、物理等不同方面的刺激，对肺脏组织逐渐造成伤害;其次受到伤害的肺组织细胞会产生自我防御措施，促使正常细胞的表型发生转变，形成具有收缩功能的肌成纤维细胞，同时促进EMT的发生，使上皮细胞失去基底膜的连接支撑而迁移和侵入，成为间充质干细胞，分泌产生EMC，促进好转或纤维化，同时相关炎性反应信号通路被激活，引起创伤部位炎性反应;通过免疫应答系统激活T淋巴细胞，增加胶原蛋白的分泌而起到修复受损肺组织的作用;最后由于有害因素的反复刺激，EMC的破坏与修复反复进行，导致EMT不断发生，炎性因子不断表达分泌，最终导致成纤维细胞过度增殖和EMC蛋白代谢异常和胶原纤维的过度沉积，出现肺纤维化[13]。肌成纤维细胞可产生大量ECM，如α-SMA，Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白等，导致细胞重塑，从而放大纤维化的级联反应[14]。胶原在肺组织中含量丰富，是ECM的一种结构蛋白质，其代谢失衡是ECM过度沉积的主要标志，其中起主要作用的是Ⅰ型和Ⅲ型胶原，主要存在于各级支气管壁和血管壁。在致纤维化因素的作用下，Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原合成代谢超过分解代谢，过多的胶原纤维在肺组织中不断沉积，导致ECM的过度积累和进行性纤维化形成，这是肺纤维化形成过程中最重要的病理改变，因此胶原含量变化是判断肺纤维化程度的一个特征性指标[15]。而在本次研究中天狼猩红染色法显示肺中模型组Ⅰ型胶原蛋白、Ⅲ型胶原蛋白增多，说明在肺纤维化过程中胶原纤维大量积聚，而在用药组中其表达均有所下降，紫檀芪对胶原沉积的抑制作用与泼尼松组比较无差异，紫檀芪抑制Ⅰ、Ⅲ型胶原为代表的ECM合成，推测其抗纤维化作用与延缓上皮细胞的转换有关。

在EMT过程中[16]，上皮细胞标记物如紧密连接蛋白-1和E-cadherin表达的减少，E-cadherin基因被抑制，E-cadherin生成减少使黏附连接点的不稳定性增加;间充质细胞标记物如α-SMA、E-cadherin、Vimentin、胶原蛋白和纤维连接蛋白的表达增加，形成了“钙粘蛋白转换”，与上皮细胞的联系减弱，肌动蛋白应力纤维形成;Vimentin基因得到活化，影响了E-cadherin与细胞膜之间的联系，使中间纤维成分发生变化。E-cadherin是一种钙依赖性黏附分子，在正常情况下将肺泡上皮细胞紧密地黏附在一起，参与调节上皮形成并维持它的完整过程，此外E-cadherin与Vimentin的表达与EMT具有紧密联系，对组织结构的形成与维持起着非常重要的作用[17]。肌成纤维细胞（Myofibroblast，MFB）具有细胞增殖及合成ECM的功能，能導致组织器官由修复向纤维化转变，是器官纤维化发展过程中最重要的效应细胞，而α-SMA是肺纤维化过程中肌成纤维细胞的特异性标志物，其表达对于肌成纤维细胞代谢和形态学特性维持起重要作用，增多可明显增强肌成纤维细胞的迁移及收缩能力，进而增强ECM的合成和分泌，表达量和肺纤维化程度成正相关，标志EMT的发生，与肺纤维化患者存活率呈负相关[18]。Nagaraja SS等[19-20]研究表明，E-cadherin为上皮细胞标志物，过量表达的α-SMA能抑制E-cadherin的表达，使上皮细胞黏附力减弱，相邻细胞间连接变得疏松而出现迁徙增强，ColⅠ、α-SMA的表达量开始逐渐上升，ECM大量沉积，发生EMT过程，进而导致纤维化的发生。本研究结果提示紫檀芪可能通过抑制EMT，使E-cadherin表达上调，减少α-SMA、Vimentin蛋白及mRNA表达，增加细胞黏附力，降低细胞侵袭能力，降低胶原蛋白的沉积，从而抑制肺泡壁增厚和肺泡损伤。

综上所述，紫檀芪可以显著抑制肺组织胶原蛋白的合成与沉积，降低大鼠纤维化肺组织中的α-SMA、Vimentin的表达能力，增加E-cadherin表达水平，有效的改善免疫平衡，降低ECM的合成，调控EMT过程而发挥抗肺纤维作用。

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（2020-07-20收稿 責任编辑：王杨）