温州地区水产品中哈维氏弧菌的耐药分析

吴 越，郑伊诺，陆荣茂，王瑶华，闫茂仓，胡 园，周朝生

( 浙江省海洋水产养殖研究所，浙江 温州 325005 )

哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)是水产养殖中常见的条件致病菌之一，可引起对虾发光病[1-2]，也可感染多种海水鱼类和贝类等，对养殖业发展造成严重影响[3-4]。此外，有研究表明，哈维氏弧菌除了是水产病原菌外，也可感染人类并致病[5]。弧菌病的防治很大程度上依赖于抗菌药的使用，但目前抗菌药物滥用现象普遍存在，细菌耐药性情况日趋严峻，引起了研究人员的密切关注。哈维氏弧菌在近十多年才逐渐被发现是水产养殖中重要的致病菌，对其研究相比于副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)等其他水产致病菌仍然较少，因此有必要对其开展耐药性方面研究。细菌对抗菌药的耐药性检测和抗性基因的检测是细菌耐药研究中的两个重要内容。对于细菌耐药性检测多采用稀释法和纸片扩散法[6-7]，其中最小抑菌质量浓度测定常用试管二倍稀释法，但试剂配制操作较为繁琐。笔者主要采用96孔药敏分析板测定最小抑菌质量浓度，操作简便，可快速检测细菌对多种抗菌药耐药性。笔者还进一步通过高通量实时荧光定量PCR较为全面地检测了样品中3种抗生素抗性基因的携带情况。由于目前对于哈维氏弧菌的耐药性研究仍然较少，且不同地区和菌株之间差异也较大，因此通过研究本地区的致病性哈维氏弧菌对14种常用抗菌药物的耐药性及3类抗性基因携带表达情况，可为重大流行病的防控提供用药指导，并为阐明哈维氏弧耐药分子机制积累重要的数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.2.1 菌株来源

11株哈维氏弧菌H1～H11均由本单位分离自温州地区发生病害的养殖海水鱼类、虾类和贝类体内，并均已做过生化鉴定和16S rRNA测序。

1.2.2 药敏分析试剂盒

水产药敏分析试剂盒(BAIVIETM)(上海柏微生物技术有限公司)；水解酪蛋白培养基和水解酪蛋白琼脂培养基(杭州天和微生物试剂有限公司)，细菌基因组DNA试剂盒(ONE-4-ALL Genomic DNA Mini-Preps Kit)[生工生物工程(上海)股份有限公司]，荧光定量PCR试剂盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)[宝生物工程(大连)有限公司]。

1.2 药敏分析

取11株供试菌种分别接种于水解酪蛋白培养基中，35 ℃培养18～24 h，用无菌涂布棒分别均匀涂布于水解酪蛋白琼脂培养基平板，35 ℃再次培养18～24 h，挑取单菌落，根据水产药敏分析试剂盒说明书检测最小抑菌质量浓度。因药敏板上未包含噁喹酸，因此细菌对噁喹酸的药敏性参考临床和实验室标准协会操作规范和文献[6]的方法，选择大肠杆菌(Escherichiacoli)ATCC 25922作为质控菌株进行测定。挑取单个菌落，接种到水解酪蛋白培养基中，35 ℃振荡培养6～8 h。将新鲜菌液调至1×108～2×108cfu/mL。按照培养基、药物、菌液的步骤依次加入96孔板中，分别设置0.125～128 mg/L的试验组，细菌对照组和空白对照组，35 ℃，16～20 h 过夜培养。

1.3 细菌基因组DNA提取

根据ONE-4-ALL Genomic DNA Mini-Preps Kit说明书提取11株细菌的基因组DNA，DNA含量与质量用Quawell Q3000检测。

1.4 抗性基因表达谱检测

细菌抗性基因表达谱由上海启因生物科技有限公司通过高通量荧光定量PCR进行分析。PCR反应体系如下：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (2×)5 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.2 μL，DNA 模板 1 μL，超纯水3 μL，反应总体系为10 μL。使用StepOnePlusTM实时荧光定量PCR平台进行检测。PCR反应条件如下：95 ℃，30 s，1个循环；95 ℃，5 s，40个循环；60 ℃，30 s，40个循环，CT检测限为40个循环。内参为16S rRNA基因，上游引物为：GGGTTGCGCTCGTTGC，下游引物为：ATGGYTGTCGTCAGCTCGTG。抗性基因类别及引物见表1。抗性基因相对丰度以基因fold值(f)表示，检测结果用TreeView软件绘制热图。fold值(f)计算公式如下：

f=2-ΔCt

△Ct=Ctarg-Ctref

式中，Ctarg为目标基因Ct值，Ctref为内参基因Ct值。

表1 抗性基因引物Tab.1 Primers used in amplification of antibiotic resistance genes

(续表1)

2 结果与分析

2.1 药敏结果

11株哈维氏弧菌对13种抗菌药物的药敏结果见表2。4种磺胺类药物中，所有菌株对磺胺嘧啶耐药率为100%，对磺胺甲噁唑的耐药率为90.91%，对磺胺间甲氧嘧啶的耐药率为81.82%，对磺胺二甲氧嘧啶则均敏感；3种喹诺酮类药物中，所有菌株对盐酸环丙沙星和恩诺沙星均敏感，对噁喹酸的敏感性存在一定差异，其最小抑菌质量浓度为0.5～2.0 mg/L；2种四环素类药物中，所有菌株对强力霉素均敏感，对土霉素的敏感性也较一致，其最小抑菌质量浓度均为0.5 mg/L；哈维氏弧菌对2种大环内酯内药物的敏感性差异较大，其中红霉素的最小抑菌质量浓度为4～32 mg/L，硫酸新霉素为1～8 mg/L；哈维氏弧菌对2种氯霉素的敏感性较一致，其中甲砜霉素盐酸的最小抑菌质量浓度均为2 mg/L，氟苯尼考的最小抑菌质量浓度均为0.25 mg/L。总体而言，11株哈维氏弧菌对盐酸环丙沙星、恩诺沙星、磺胺二甲氧嘧啶和强力霉素敏感，对磺胺嘧啶和氨苄西林钠耐药，表明本试验中哈维氏弧菌对四环素类抗菌药较为敏感，对磺胺类和β-内酰胺类药物耐药率较高，且大部分菌株已经出现多重耐药性。

2.2 抗性基因表达谱检测

通过高通量实时荧光定量PCR方法检测了抗性基因在哈维氏弧菌中的携带情况与相对丰度(图1)。所有菌株中均有检出磺胺类抗性基因，其中sul1的检出率最高，达81.82%，其次为sul2和sul3，分别为63.64%和72.73%，sulA的检出率最低，为9.09%。4种磺胺类基因中sul2的相对丰度最高，sulA的相对丰度最低。

11株哈维氏弧菌中，除H2菌株外，其他所有菌株均有检出喹诺酮类抗性基因，其中qnrD在菌株中检出率最高为63.64%，其次分别为qepA和parC，检出率分别为37.36%和18.19%，qnrA、qnrB、qnrC和qnrS在所有菌株中均未检出。几种喹诺酮类抗性基因中，qnrD基因相对丰度最高。

所有菌株中均有检出携带四环素类抗性基因，其中tet34、tet35和tet36检出率最高均为100%，tet38、tet A、tet D、tet E、tet H、tet J、tet L和tet S在所有菌株中均未检出。在四环素类抗性基因中，tet34和tet35的相对丰度较高，tet36虽然在所有菌株中均有检出，但在各个菌株中相对丰度均较低。

表2 哈维氏弧菌耐药性分析结果Tab.2 Susceptibility results of V. harveyi strain

图1 哈维氏弧菌对磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗性基因表达谱 Fig.1 The expression profile of resistance genes of sulfonamides, quinolone and tetracycline in V. harveyi

3 讨 论

3.1 哈维氏弧菌耐药性

本试验检测了来自不同水产动物的11株哈维氏弧菌对14种水产渔药的敏感性，结果显示，所有哈维氏弧菌对喹诺酮类的盐酸环丙沙星、恩诺沙星，磺胺类的磺胺二甲氧嘧啶和四环素类的强力霉素均敏感，因此在水产养殖过程中可以优先考虑选用这几种抗菌药物进行哈维氏弧菌病害的防治。另外，噁喹酸、土霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等对哈维氏弧菌的最小抑菌质量浓度均较小(≤2 mg/L)，可作为备选的药物。本研究中哈维氏弧菌药敏结果与文献[8-9]等的研究结果不完全一致，这可能是由菌株宿主、来源以及养殖环境理化性质及养殖过程中抗菌药使用情况存在差异所致，这也说明在水产病害防治中应参照致病菌的药敏结果进行抗菌药物的选择，但是与其他研究相似，本研究中大部分菌株也已经产生了多重耐药性，不过多重耐药的情况还不是十分严重，菌株同时耐受的抗菌药的种类还较少。本试验中，哈维氏弧菌对磺胺类药物的耐药表型较为突出。弧菌对磺胺耐药的报道较为常见。刘旭[10]研究了副溶血性弧菌、哈维氏耐药性和创伤弧菌(V.vulnificus)等13种90株弧菌的耐药谱，其中磺胺类的磺胺甲恶唑耐药率高达74.4%；刘迪[11]研究了10株哈维氏弧菌对16种抗菌药的耐药性，其中磺胺甲恶唑耐药率为40%。与上述研究相比，本试验中菌株磺胺类耐药的检出率更高，种类也更多，说明本地区磺胺类药物耐药情况更为严重，因此在本地区水产养殖病害临床治疗中应减少磺胺类药物的使用。本试验中所有菌株对氨苄青霉素的耐药情况也很明显，耐药检出率高达100%。诸多研究表明，弧菌对氨苄青霉素普遍具有抗性。吴立婷等[6]对54株哈维氏弧菌进行13种抗菌药的药敏分析发现，所有菌株对氨苄西林均耐药；而王春艳等[12]研究了哈维氏弧菌对先锋必素、先锋霉素Ⅳ、先锋霉素Ⅵ、单环菌素、美福仙等其他β-内酰胺类抗生素的药敏性，发现耐药率均超92%，进一步PCR检测发现所有菌株均携带TEM型β-内酰胺酶。β-内酰胺类抗生素的高耐药率也被发现于其他弧菌中。江艳华等[13]对84株副溶血性弧菌进行21种抗生素的耐药性分析，结果发现，其对氨苄青霉素的耐药率最高，为91.7%。有研究认为，弧菌普遍对β-内酰胺类抗生素具有抗性，主要机制之一是产生β-内酰胺酶降解β-内酰胺类抗生素[14]。研究发现，弧菌除了对氨苄西林高度耐受外，对早期使用的第1代和第2代头孢类抗生素也高度耐受[15-16]，而这些药物在水产养殖过程中极少使用，因此推测弧菌对某些β-内酰胺类抗生素存在固有耐药性也是弧菌对β-内酰胺类抗生素不敏感的原因之一。

3.2 哈维氏抗性基因表达谱

细菌对抗菌药物的抗性机制不尽相同，但抗性基因的诱导表达是细菌产生抗性的共同特点。在前期开展的温州市水产品质量安全监测工作中发现，磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗菌药物的检出率较高。磺胺类、喹诺酮类和四环素类药物是水产养殖环境中常见的抗菌药物[17]，因此本研究通过高通量荧光定量PCR进一步检测了11株哈维氏弧菌中这3类抗性基因的携带情况。高通量荧光定量PCR最早由美国WaferGen公司研发[18]，它能直接进行几百至上千个基因扩增反应，且所需的反应体系在纳米级。传统的荧光PCR存在单次研究的基因种类数量等信息有限的缺点，高通量荧光定量PCR具有强大的检测能力和更大通量的反应，可更加高效全面地进行基因表达分析。高通量荧光定量PCR已经被运用于环境中抗性基因的检测[19-20]，但用于细菌携带抗性基因检测的研究仍鲜见报导。本研究将高通量荧光定量PCR方法用于哈维氏弧菌中磺胺类、氟喹诺酮类和四环素类抗性基因的检测，发现3类抗性基因在11株哈维氏弧菌中均有检出。

细菌对磺胺类药物的抗性主要与sul1、sul2、sul3、sulA等抗性基因有关。本试验所有菌株中都有检出携带磺胺类抗性基因，其中sul2的相对丰度最高。王瑞旋等[21-22]报道，自杂色鲍(Haliotisdiversicolor)和圆眼燕鱼(Plataxorbicularis)等水产动物中分离的哈维氏弧菌中均鉴定出携带sul2基因，与本研究结果相似。结合11株哈维氏弧菌对4种磺胺类药物中的3种均已产生较高程度耐药性的药敏结果，说明哈维氏弧菌磺胺类的耐药表型和磺胺类抗性基因的携带情况可能存在一定的相关性，但对磺胺二甲氧嘧啶仍然高度敏感，推测可能与此地区磺胺类用药的种类及频率有关，这也表明耐药表型与抗性基因携带并不是完全一致。喹诺酮也是一类在水产养殖中被广泛使用的抗菌药。研究认为残留在水产养殖环境中的喹诺酮类药物会导致水生细菌产生喹诺酮抗性[23]。本试验中11株哈维氏弧菌的qnrD基因检出率及相对丰度均最高。张文文[24]检测了32株水产致病菌中喹诺酮类抗性基因，结果也显示qnrD检出率最高，这与本试验结果一致，表明qnrD可能是水产致病菌中较为普遍存在的喹诺酮类抗性基因。本试验中11株哈维氏弧菌对盐酸环丙沙星和恩诺沙星均敏感，对噁喹酸的最小抑菌质量浓度也较小，但荧光定量PCR检测结果表明，91%的菌株携带喹诺酮类抗性基因。王小亮等[25]研究鱼源病原菌也发现，喹诺酮类的抗性基因阳性检出率显著高于耐药检出率，与本试验结果相似，说明喹诺酮抗性基因的携带与耐药表型并不一致。另外本试验中四环素类也有类似情况，所有菌株中均有检出四环素类抗性基因，其中tet34、tet35的检出率及丰度均占优势。Nonaka等[26]发现，海水鱼中分离的携带tet34的弧菌可表达高水平四环素抗性。本试验中tet34和tet35在所有菌株中均有检出且相对丰度整体较高，然而所有菌株对2种四环素类药物中的土霉素的最小抑菌质量浓度均较低，对强力霉素均较为敏感，表明四环素类抗性基因携带与耐药性情况明显不一致。本试验结果表明，弧菌的耐药表型与抗性基因携带常常并不一致，其丰度高低与菌株的耐药程度也不一定呈正相关。这可能是多种原因引起，如抗性基因发生变异引起功能减弱或功能丧失，也可能是由于抗性基因在菌株受到相应抗生素处理时表达受到抑制等等。因此，细菌抗性基因表达与耐药表型和耐药程度的关系值得进一步研究。

4 结 论

本试验中收集的温州地区11株哈维氏弧菌对四环素类抗菌药物较为敏感，对磺胺类和β-内酰胺类药物耐药率较高，且大部分菌株已经出现多重耐药性。所有哈维氏弧菌均携带磺胺类、喹诺酮类和四环素类抗性基因，其中磺胺类耐药表型和抗性基因的携带存在一定相关性，而喹诺酮类和四环素类耐药表型和抗性基因之间则明显不一致。