姜黄素对过度训练大鼠骨骼肌Nrf2通路相关蛋白质表达及细胞凋亡的影响

牛衍龙,曹建民,王 祯,周海涛,龚 平,胡 戈,田旭宸,邵芙蓉

(1.赣南医学院康复学院,中国江西赣州341000；2.北京体育大学运动人体科学学院,中国北京100084；3.北京联合大学生物化学工程学院,中国北京100023；4.北京联合大学生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,中国北京100191；5.长治医学院,中国山西长治046000)

竞技体育运动中,教练员和运动员为追求“更高、更快、更强”,常采用超负荷训练以期提高运动和竞技能力。受运动强度、恢复时间等多重因素影响,这一训练方式在实际应用中常因运用不当,引发过度训练综合症。课题组前期研究显示,过度训练可导致机体氧化应激水平提高,骨骼肌发生氧化应激损伤[1～2],心脏[3]、肾脏[4]细胞凋亡增加,相关组织结构改变及功能损伤。核因子E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2,Nrf2)作为机体抵抗氧化应激的关键转录因子,受到Kelch样环氧氯丙烷(ECH)相关蛋白-1(Kelchlike ECH-associated protein 1,Keap1)的调节,在机体发生氧化应激时,易位至细胞核,作用于抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE),诱导下游多种抗氧化蛋白的转录,提高机体抗氧化能力。Nrf2还可通过调节抗凋亡因子Bcl-2的水平,防止细胞凋亡[5]。诸多研究发现,姜黄素(curcumin)作为天然二酮类化合物可有效缓解运动引起的氧化应激,改善骨骼肌损伤[6～7]。本实验在前期研究基础上,通过观察大鼠骨骼肌组织形态,检测骨骼肌氧化应激水平、细胞凋亡水平以及骨骼肌损伤标志物、Nrf2通路相关蛋白质及凋亡因子的表达,探究姜黄素缓解过度训练所致骨骼肌细胞凋亡及结构/功能损伤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

本研究所选用7周龄SPF (specific pathogen free)级 Wistar大鼠(体重:218.4 g±10.7 g)由北京大学医学部实验动物科学部提供,动物生产合格证编号:SCXK(京)2016-0010。实验动物在北京体育大学SPF级动物实验室进行饲养、训练,环境条件如下:温度(22±2)℃,相对湿度55%～75%,昼夜交替各12 h。

1.1.2 主要仪器

7020全自动生化分析仪(HITACHI公司,日本)；Wellscan MK3 酶标仪(Thermo Labsystems公司,美国)；Pannoramic MIDI全自动数字切片扫描系统(3D HISTECH公司,匈牙利)；Nikon 50i光学显微镜(Nikon公司,日本)；Allegra 25R台式高速离心机(Beckman Coulter公司,美国)；NR-B17CC超低温冰箱(Panasonnic公司,日本)；ISO9001电子天秤(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；DY89-Ⅱ电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；DK-2000-ⅢL型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.1.3 主要试剂

姜黄素(纯度＞99%,陕西源泰生物科技有限公司)；羧甲基纤维素钠(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；睾酮(testosterone,T)和皮质酮的(corticosterone,Cor)放射免疫试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的酶联免疫试剂盒(北京华英生物技术研究所)；TUNEL试剂盒(瑞士Roche公司)；Nrf2、血红素氧合酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、Bcl-2和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)的抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组

75只Wistar大鼠预适应喂养4 d,随后施加3 d适应性游泳训练(运动量20 min/d),剔除不能完成游泳训练的大鼠3只。在充分考虑过度训练可能致死的情况下,将余下72只大鼠随机分为安静组(C)12只、姜黄素组(CC)12只、过度训练模型组(OM)24只及姜黄素干预组(COM)24只。

1.2.2 训练方案

C及CC组不进行任何运动干预,OM及COM组大鼠参照课题组前期设计方案(图1)[4]进行8周递增负荷游泳训练。训练中,若大鼠沉入水中10 s无法上浮,则将其托离水面休息5～10 min,随后继续训练,完成当日方案。

1.2.3 营养干预方案

姜黄素用0.5%羧甲基纤维素钠配制成悬浊液,4℃存储。CC组与COM组在每天第一次训练开始前1 h灌胃1次,剂量为200 mg/(kg·d),体积为5 mL/kg；C组与OM组每天灌胃等体积的0.5%羧甲基纤维素钠。

1.2.4 样品制备及检测

8周实验结束后,OM组及COM组由于部分大鼠死亡,分别剩余11只、14只。末次训练结束24 h后使用乙醚麻醉大鼠,颈动脉取血致死。分离并切取0.5 cm×0.5 cm×1 cm体积的比目鱼肌投入4%多聚甲醛中固定,剩余肌肉以锡纸包裹放入-80℃冰箱待用。血液样本4℃静置24 h后,于4℃ 3 000 r/min离心10 min,留取血清。骨骼肌SOD活性及MDA含量的检测参照酶联免疫试剂盒实施；Nrf2、HO-1、Bcl-2和Bax等蛋白质的表达水平采用免疫组化法检测[8]；血清T、Cor的检测采用放射免疫法,主要操作参照放射免疫试剂盒的说明书；血清CK和LDH采用全自动生化分析仪测定。

图1 大鼠游泳训练方案[4]游泳训练负荷的表示方式为:训练时间(min)*负荷(体重百分比)*训练频次(次)。Fig.1 Training program[4]The training load is shown as:time(min)*load(percentage of body weight)*frequency(times).

1.2.5 HE染色

组织固定24 h后取出,流水清洗24 h,乙醇梯度脱水后进行石蜡包埋。切取4 μm厚度的石蜡切片置于载玻片上,60℃烘烤后HE染色,400倍光学显微镜下观察骨骼肌的组织形态。

1.2.6 TUNEL法检测细胞凋亡

将石蜡切片进行充分的脱蜡和水化,磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS,pH=7.4)清洗后滴加蛋白酶K溶液,37℃孵育15 min。再次以PBS(pH=7.4)清洗,使用牛血清封闭,随后滴加TUNEL反应液,37℃孵育60 min。加入3%的过氧化氢溶液封阻,室温孵育10 min。加入适量converter-POD,37℃孵育30 min。清洗后DAB显色,常规脱水后使用中性树胶封片,显微镜下观察、选片。

1.2.7 H-score评分

组织切片经全视野数字扫描,识别各强度阳性和阴性面积(单位:像素)以及阳性百分比,代入公式计算H-score[9]。细胞核阳性由强至弱依次为深棕色、棕黄色、浅黄色,蓝色为阴性。H-score=(浅黄色细胞密度×1)+(棕黄色细胞密度×2)+(深棕色细胞密度×3)。骨骼肌组织中Nrf2、HO-1、Bcl-2和Bax的表达结果及细胞凋亡水平均以H-score形式表示。

1.2.8 数据处理

2 结果

2.1 运动及营养干预对大鼠血液指标的影响

血清T/Cor比值是评价运动负荷状况及诊断过度训练的金标准[10]。血液中CK、LDH等骨骼肌细胞渗出物的活性可以有效反映骨骼肌损伤程度[11]。为评测过度训练动物模型是否成功建立、运动及营养干预对大鼠骨骼肌损伤相关标志物的影响,本实验分离并检测了大鼠血清中T和Cor的含量,以及CK和LDH的活性。结果显示:CC组血清T和Cor及T/Cor比值与C组无显著性差异；OM组T及T/Cor比值显著低于C组(P＜0.01),同时Cor含量、CK及LDH活性显著高于C组(P＜0.01)；COM组血清T及T/Cor比值显著高于OM组(P＜0.01),而Cor含量、CK及LDH活性显著低于OM组(P＜0.01)。具体数据见表1。

2.2 运动及营养干预对大鼠骨骼肌组织形态的影响

为评价运动及营养干预对大鼠骨骼肌组织形态的影响,本实验对大鼠骨骼肌进行了HE染色及显微观察。光镜观察结果显示:C与CC组大鼠的骨骼肌形态正常,细胞核未见肿胀、固缩现象；OM组骨骼肌肌纤维间细胞增生,有大量炎性细胞浸润,血管周围胶原增生严重；COM组大鼠的骨骼肌损伤程度轻于OM组,仅轻度的肌纤维间细胞增生和炎性细胞浸润(图2)。

2.3 运动及营养干预对大鼠骨骼肌氧化应激水平的影响

为观察运动及营养干预对大鼠骨骼肌氧化应激水平的影响,本实验采用酶联免疫吸附法检测了骨骼肌的SOD活性和MDA含量。结果显示:CC组的SOD和MDA指标与C组相比无显著性差异；OM组的SOD活性显著低于C组(P＜0.01),而MDA含量显著高于C组(P＜0.01)；COM组的SOD活性显著高于OM组(P＜0.01),而MDA含量显著低于OM组(P＜0.01)。具体数据见表2。

表1 运动及营养干预对大鼠血液指标的影响Table 1 Effects of exercise and nutrition intervention on blood parameters in rats

2.4 运动及营养干预对大鼠骨骼肌细胞凋亡水平的影响

为观察运动及营养干预对大鼠骨骼肌细胞凋亡水平的影响,本实验采用TUNEL法及免疫组化法检测了骨骼肌细胞的凋亡水平及相关蛋白质Bcl-2和Bax的表达,结果显示:CC组骨骼肌凋亡水平、Bcl-2和Bax的表达水平及两者比值与C组相比无显著性差异；OM组骨骼肌凋亡水平及Bax表达水平均显著高于C组(P＜0.01),而Bcl-2的表达水平(P＜0.05)及 Bcl-2/Bax 比值(P＜0.01)显著低于C组；COM组骨骼肌凋亡水平(P＜0.01)及Bax表达水平(P＜0.05)均显著低于OM组,而Bcl-2/Bax比值显著高于OM组(P＜0.05)；另外,Bcl-2的表达水平在COM组与OM组之间无显著变化(P＞0.05)。具体数据见图3、图4和表3。

图2 大鼠骨骼肌的组织形态(HE,400×)C:安静组；CC:姜黄素组；OM:过度训练模型组；COM:姜黄素干预组(下同)。大鼠末次训练结束24 h后,取比目鱼肌进行HE染色和组织病理学诊断。图片为各组大鼠中具有代表性的比目鱼肌显微照片,标尺为20 μm。红色箭头:肌纤维间细胞增生；蓝色箭头:炎性细胞浸润。Fig.2 Skeletal muscle tissue morphology of rats(HE,400×)C:Control group；CC:Curcumin group；OM:Overtraining model group；COM:Curcumin treatment combined with overtraining group(the same below).Histopathological examination of soleus was performed using HE staining 24 h after the last training of rats.Representative microphotographs were taken from the soleus of C,CC,OM and COM groups.Scale bar:20 μm；Red arrow:Myofibroblasts hyperplasia；Blue arrow:Inflammatory cell infiltration.

表2 运动及营养干预对大鼠骨骼肌中SOD、MDA的影响Table 2 Effects of exercise and nutrition intervention on levels of SOD and MDA in skeletal muscle of rats

2.5 运动及营养干预对大鼠Nrf2通路相关蛋白质表达的影响

Nrf2是机体内发挥抗氧化作用的关键分子,本实验使用免疫组化法检测了骨骼肌中Nrf2及其下游HO-1蛋白的表达,结果显示OM组的Nrf2、HO-1水平显著低于C组(P＜0.05)；COM 组的Nrf2、HO-1水平显著高于OM组(P＜0.05),具体数据见图5及表4。

3 讨论

本研究通过对大鼠施加8周递增负荷游泳训练,建立了过度训练动物模型,并通过检测血清睾酮(T)与皮质酮(Cor)比值来反映运动负荷。实验结果显示,OM组大鼠的血清T/Cor比值显著低于C组,下降幅度高达85.05%,符合过度训练诊断标准(血清T/Cor比值下降40%)[12],提示造模成功。

图3 各组大鼠的骨骼肌细胞凋亡水平采用TUNEL法检测比目鱼肌细胞凋亡水平。显微镜下视野细胞核阳性由强至弱依次为深棕色、棕黄色、浅黄色,蓝色为阴性。放大倍数是400倍,标尺是20 μm。Fig.3 Apoptosis of skeletal muscle cells in each group of ratsThe apoptosis levels of soleus cells were detected by TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling).Under the microscope,the positive nuclei of apoptotic cells(from strong to weak)were dark brown,brownish yellow and light yellow,respectively,and the negative ones were stained blue.The magnification is 400× and the scale bar is 20 μm.

表3 运动及营养干预对大鼠骨骼肌凋亡及Bcl-2和Bax表达的影响Table 3 Effects of exercise and nutrition intervention on apoptosis and expressions of Bcl-2 and Bax in skeletal muscle of rats

表4 运动及营养干预对大鼠骨骼肌Nrf2、HO-1表达的影响Table 4 Effects of exercise and nutrition intervention on expressions of Nrf2 and HO-1 in skeletal muscle of rats

图4 大鼠骨骼肌中Bcl-2和Bax的表达采用免疫组织化学(石蜡切片)法检测Bcl-2和Bax的表达。(A)各组大鼠中代表性的Bcl-2蛋白表达结果；(B)各组大鼠中代表性的Bax蛋白表达结果。蛋白质表达分析以切片阳性细胞数和染色强度为依据。显微镜下视野细胞核阳性由强至弱依次为深棕色、棕黄色、浅黄色,蓝色为阴性。放大倍数是400倍,标尺是20 μm。Fig.4 The expressions of Bcl-2 and Bax in skeletal muscle of ratsImmunohistochemistry analysis(paraffin section)was employed to test the expressions of Bcl-2 and Bax.(A)A representative expression result of Bcl-2 in each group；(B)A representative expression result of Bax in each group.Analysis of protein expression was based on the number of positive cells and staining intensity in the sections.Under the microscope,the positive nuclei of apoptotic cells(from strong to weak)were dark brown,brownish yellow and light yellow,respectively,and the negative ones were stained blue.The magnification is 400× and the scale bar is 20 μm.

图5 大鼠骨骼肌中Nrf2和HO-1的表达采用免疫组织化学(石蜡切片)法检测Nrf2和HO-1的表达。(A)各组大鼠中代表性的Nrf2蛋白表达结果；(B)各组大鼠中代表性的HO-1蛋白表达结果。蛋白质表达分析以切片阳性细胞数和染色强度为依据。显微镜下视野细胞核阳性由强至弱依次为深棕色、棕黄色、浅黄色,蓝色为阴性。放大倍数是400倍。Fig.5 The expressions of Nrf2 and HO-1 in skeletal muscle of ratsImmunohistochemistry analysis(paraffin section)was employed to test the expressions of Nrf2 and HO-1.(A)A representative expression result of Nrf2 in each group；(B)A representative expression result of HO-1 in each group.Analysis of protein expression was based on the number of positive cells and staining intensity in the sections.Under the microscope,the positive nuclei of apoptotic cells(from strong to weak)were dark brown,brownish yellow and light yellow,respectively,and the negative ones were stained blue.The magnification is 400×.

CK和LDH是骨骼肌损伤的标志酶[11,13],MDA与SOD则分别反映脂质过氧化程度及自由基清除能力。在本研究中,与C组大鼠相比,OM组大鼠的骨骼肌组织形态发生明显病理性改变,炎性细胞浸润明显增多,且血清CK、LDH活性显著升高,骨骼肌MDA含量显著增加,SOD活性显著降低,提示OM组大鼠的氧化应激加剧,机体抗氧化能力受损；当给训练大鼠同时补充姜黄素时,与单纯训练组相比,大鼠骨骼肌的病理学改变得到改善,同时血清CK、LDH活性显著降低,骨骼肌MDA含量降低,SOD活性增加,说明姜黄素可在一定程度上减轻过度训练所致的氧化应激及骨骼肌损伤。Nrf2是抗氧化过程的调节因子,在机体氧化应激水平较低时与Keap1结合,使自身活性受到抑制；而当氧化应激加剧时,Nrf2与Keap1分离并转移至细胞核,随后通过与ARE结合,诱导诸多抗氧化蛋白及Ⅱ相解毒酶的转录,发挥其拮抗氧化应激的职责[14]。HO-1位于Nrf2下游,同样参与机体抗氧化过程。研究表明,急性运动可激活骨骼肌Nrf2信号通路,提高机体抗氧化能力以应对氧化应激[15]；但长时间大强度运动会引起体内活性氧过量积累,骨骼肌Nrf2蛋白水平降低,导致骨骼肌结构/功能受损[16]。本研究结果显示:就Nrf2与HO-1的水平而言,OM组较C组显著降低,提示过度训练抑制了骨骼肌Nrf2信号通路相关蛋白质的表达；而COM组较OM组显著升高,说明训练期间姜黄素的干预可促进骨骼肌Nrf2信号及其调控的抗氧化蛋白活性升高。Bcl-2和Bax是具有代表性的抗/促凋亡蛋白,二者比值变化在一定程度上可反映细胞凋亡的发生趋势[17]。Tsai等[18]研究表明,Bcl-2受到Nrf2的调节,在Nrf2基因敲减心肌细胞中Bcl-2水平降低,高血糖诱导的细胞凋亡加剧。本研究发现,与C组相比,OM组的骨骼肌凋亡水平及促凋亡蛋白Bax水平均显著升高,同时抗凋亡蛋白Bcl-2的水平显著降低；与OM组相比,COM组中抗凋亡蛋白Bcl-2的水平显著升高,同时骨骼肌凋亡水平及促凋亡蛋白Bax水平显著降低。上述实验结果有力地说明过度训练使得机体氧化应激加剧,活性氧过量积累,Nrf2信号通路相关蛋白质表达下调,进而引发骨骼肌细胞凋亡,这可能是骨骼肌组织形态/功能受损的原因之一,而训练期间补充姜黄素可以缓解过度训练所致骨骼肌细胞凋亡及结构/功能损伤,其机制可能是:姜黄素通过激活过度训练大鼠骨骼肌Nrf2通路,上调相关蛋白质的表达,提高骨骼肌中抗氧化酶的活性,减轻氧化应激水平。另外,Peng等[19]的研究显示,C57BL/6小鼠通过7 d的200 mg/(kg·d)姜黄素口服干预,肝中Nrf2 mRNA水平显著升高,但Nrf2蛋白的表达水平未发生显著变化,同时HO-1、SOD、过氧化氢酶(catalase,CAT)的活性以及MDA和谷胱甘肽(glutathione,GSH)的含量也未发生显著变化,这与本文的研究结果一致。在本研究中,CC组大鼠在静息状态下补充姜黄素后,Nrf2和HO-1的表达水平以及Nrf2下游抗氧化酶SOD的活性与C组相比均未发生显著变化,这进一步证实姜黄素对正常状态下骨骼肌中Nrf2及其下游抗氧化蛋白质的表达/活性的影响有限。

综上所述,过度训练可抑制骨骼肌Nrf2信号通路相关蛋白质的表达,使机体氧化应激水平升高,抗氧化能力下降,细胞凋亡加剧,组织形态发生病理性改变,即肌纤维结构受损,炎性细胞浸润增多；而补充姜黄素可激活Nrf2通路及相关蛋白质的表达,提高抗氧化酶活性,减轻氧化应激水平,缓解骨骼肌凋亡及结构/功能损伤。