食品中呈鲜味物质研究进展

郇思琪,刘登勇,2,*,王笑丹,张庆永

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013; 2.江苏省肉类生产与加工质量安全控制协同创新中心,江苏南京 210095; 3.吉林大学食品科学与工程学院,吉林长春 130062; 4.山东德州扒鸡股份有限公司,山东德州 253003)

食物的滋味有千百种,但是基本味只有五种:酸、甜、苦、咸、鲜[1]。其中,前四种基本味经过人们早期发现和长期探索,已明确了它们的感知机理,而作为第五位的鲜味则尤为特殊。一方面是由于鲜味常在食物中与其他味道结合在一起出现时,使人难以察觉,直到上个世纪初,才被日本池田菊苗教授发现并且正式命名,这使得人们对它的认识和研究起步较晚;另一方面则是由于它的感知受体结构尚未解析,呈味机理尚存争议[2-3]。近年来,对于鲜味物质,已有明确分类,鲜味的呈味机理还在不断探索中,而对于鲜味物质的检测也从一开始较为简易、粗略的化学分析法[4]、紫外分光光度法[5]等方法发展为高效准确的电子舌检测[6]、氨基酸分析仪法[7]、高效液相色谱法[8]等。本文对于前人的研究进行综述,从鲜味物质本身出发,对其提取、分类、感知机理、较新的检测方法的研究进展进行总结,旨在为研究食品中的鲜味物质提供一定参考价值。

1 呈鲜味的食物

其实大多数的食材最初鲜味并不突出,只有经过烹调加工后,食材中的蛋白质分解转化为小分子的多肽和游离氨基酸(Free amino acid,FAAs),核酸转化为小分子的5′-核苷酸,鲜味才能得到更大化的呈现[9];另外,5′-核苷酸可以和鲜味游离氨基酸发生协同作用,达到1+1>2的效果,从而使得食物的鲜味更加浓郁。

食物之所以呈现鲜味,主要是因为食物中含有对鲜味贡献较大的鲜味物质,其中最具有代表性的鲜味物质就是L-谷氨酸(L-Glutamic acid,L-Glu)、天门冬氨酸(Aspartic acid,Asp)、5′-鸟苷酸(5′-guanylic acid,5′-GMP)和5′-肌苷酸(Inosine 5′-monophosphate,5′-IMP)[10]。L-Glu主要存在于鱼、大豆及其发酵制品中,5′-IMP主要存在于海鲜和畜禽肉类中,而5′-GMP则主要存在于菌类比如香菇中[11]。

影响食物的鲜味因素主要有养殖种植方法、加工处理方式、搭配食物及贮存方法。余昌霞等[12]探究了五种不同培养基质对草菇呈味物质的影响,发现以棉籽壳为基质所培养的草菇等鲜浓度值最高,粗蛋白及水解氨基酸含量及组成最优,说明棉籽壳可以作为优质鲜味草菇栽培的培养基质。Cai等[13]探究了4种不同干燥方式对中国对虾风味的影响,发现利用微波真空-冷风联合干燥后的对虾等鲜值提高,且呈味游离氨基酸含量下降不严重,对于对虾的鲜味变化影响最小。Sato等[14]研究了日本传统绿茶对于日本料理的感官特性的影响,发现涩味较低的绿茶对于日本料理的鲜味具有协同增效的作用,同时能够增加其厚味。Li 等[15]分别研究了低温和超低温贮藏对黄羽鸡鸡汤中挥发性和非挥发性风味物质的影响,结果发现与低温贮藏相比,超低温贮藏在21～24 d时,鸡汤中的鲜味游离氨基酸与5′-核苷酸含量更高,这充分说明超低温贮藏能够有效延长鲜味物质的保存期。

鲜味来源于食物,目前增鲜剂的提取原材料及方法在不断更新。现代传统味精的工业生产原料是酵母,酵母是一种真菌,当单个酵母细胞分裂开,细胞自身的酶可以通过水解作用分解蛋白质,从而释放出大量的谷氨酸,经过一系列的抽提精炼等过程便可制成味精[16-17]。近些年,常有研究以畜禽骨渣为原料提取鲜味风味良好的调味剂。Wang 等[18]运用热压萃取技术对鸡骨渣中的蛋白质、胶原蛋白和矿物质等进行提取,将其转化为一种营养的鲜味调味底物。Liao 等[19]以河豚头部与尾部为原料,通过酶解和美拉德反应得到了热稳定性良好且具有强烈鲜味的蛋白副产物。Xu 等[20]以牛骨髓为原料,通过酶解反应和热反应可以得到肉香味和鲜味物质含量高,异味物质含量低的调味料。

2 鲜味的呈味物质

2.1 氨基酸

鲜味氨基酸的代表性物质主要有谷氨酸和天门冬氨酸两种,然而只有它们的L-型构象能够呈现鲜味,D-型异构体却并无鲜味。L-谷氨酸拥有两个羧基残基,羧基残基的解离常数是4.25,在中性pH条件下可以产生—COO-基团[21]。若将氢氧化钠和谷氨酸混合,便可以得到具有明显鲜味的谷氨酸钠晶体,即味精的主要成分。由于鲜味是由谷氨酸结构中阴离子引起的,所以谷氨酸钾和谷氨酸钙也具有鲜味。谷氨酸热稳定性较好,所以富含谷氨酸的食物经过高温加热后,依然能够呈现良好的鲜味风味。不同食物中的L-Glu也不尽相同,鸡肉、牛肉、猪肉的谷氨酸含量分别为44、33、23 mg/100 g[22-23]。天门冬氨酸与谷氨酸同属于酸性氨基酸,它们俩也是仅有的两种酸性氨基酸,天门冬氨酸不仅是食品工业领域常用的营养增补剂,而且在医药方面有着广泛的应用,可以用来治疗高血压症、缓解疲劳,作为氨解毒剂、肝功能促进剂等。

2.2 核苷酸

在5′-核苷酸中,5′-IMP、5′-GMP和5′-AMP(Adenosine Triphosphate)对食品鲜味的贡献最为突出。5′-IMP在畜禽肉中占主导地位,鸡肉、牛肉和猪肉中的5′-IMP含量分别为115、163、186 mg/100 g。5′-IMP主要由细胞中的三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)分解产生,分解过程可以简化为:ATP→ADP→AMP→IMP,这整个分解过程通常发生在动物死后的僵直期[24]。以大菱鲆为例,鱼肉中的5′-IMP产生过程是在鱼体死后进行的,鱼肉中的5′-IMP的浓度在鱼死后大约10 h能够达到最高值,所以刚刚被杀死的鱼并不如死后10 h的鱼味道鲜美[25]。而5′-GMP主要存在于可食用菌中,干香菇中的5′-GMP含量为156.5 mg/100 g(是新鲜香菇的3倍),它是由核糖核酸酶分解核糖核酸产生的,香菇在干燥过程中,细胞破裂,细胞中的核糖核酸酶能够充分作用于核糖核酸,使得干香菇中的5′-GMP含量得到明显提升。而干香菇在烹饪前,需要用冷水泡发,这是因为在室温下5′-GMP容易被核苷酸酶分解为鸟苷,烹饪时的温度也应迅速提升至60～70 ℃以避免大量的5′-GMP的分解和流失[26]。5′-AMP主要存在于贝类或软体动物中,扇贝、鱿鱼和龙虾中的5′-AMP含量分别为116、184、82 mg/100 g。

2.3 肽

除了氨基酸和核苷酸,一些小分子多肽也表现出鲜味。时至今日,据统计已有75种多肽具有鲜味[27],包括24种二肽、17种三肽、4种四肽、5种五肽、8种六肽、4种七肽、8种八肽、2种九肽、2种十一肽和1种十五肽,其中Asp与丙氨酸形成的二肽呈现强烈的鲜味,Asp与Glu形成的二肽同时呈现咸味和鲜味,而Glu、丝氨酸、亮氨酸和丙氨酸形成的四肽则同时呈现酸味、鲜味和苦味,其中酸味>鲜味>苦味。在这75种鲜味肽中仍有20种多肽(包括14个二肽、5个三肽和1个八肽)的味道存在争议,即存在几种多肽从水解物中分离出来时可以表现出鲜味的,但当通过人工合成方法得到时却不能呈现鲜味[28]。这有可能是因为:a.水解产生的鲜味多肽与合成产生的鲜味多肽在空间结构上的差异可能影响了鲜味多肽的风味分析,多肽合成过程中氨基酸异构形式引起的空间结构变化可能影响肽的鲜味;b.鲜味多肽与其他化合物的相互作用可能会干扰其呈鲜机制[29]。

2.4 有机酸

呈鲜味的有机酸类主要有琥珀酸盐、没食子酸、五倍子酸。其中琥珀酸盐最具代表性,琥珀酸二钠(Succinic acid disodium salt)是有机酸呈现鲜味的代表物质,它多存在于贝类及香菇中。具有较好的稳定性和溶解性,与谷氨酸钠按照一定的比例混合使用时,会有协同增效的作用。琥珀酸一钠不仅具有鲜味,还具有酸味,其呈鲜味阈值是琥珀酸二钠的1/2倍[30]。

2.5 有机碱

甜菜碱(Betaine)和氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide)是呈鲜味有机碱的代表物质。甜菜碱主要存在于甜菜糖的糖蜜中,具有强烈的吸湿功能,它能够与谷氨酸钠、琥珀酸等呈味物质共同作用使海产品呈现独特的鲜味[31]。而氧化三甲胺兼具鲜味与甜味,常存在于水产品中,当水产品体内酶发生作用而分解氧化三甲胺,就会产生难闻的鱼腥味[32]。

3 鲜味的呈味机理

3.1 鲜味受体

鲜味与其它基本味的感知途径相似,由呈味物质刺激口腔味蕾上皮细胞中的味觉受体,通过味觉神经将信号传导至大脑味觉中枢,再经过大脑综合神经中枢的系统分析,最终产生味感[33]。到目前为止,还没有关于鲜味感知的统一理论,但已发现两种鲜味受体:异源二聚体T1R1/T1R3、味型代谢性谷氨酸受体mGluR4[34];它们都属于G蛋白偶联受体家族C亚族(C-GPCR)[35],胞外有类似捕蝇草形状的结构域,具体由两个部分组成:大的细胞外N-维纳斯捕蝇草结构域(VFT)、由一个富含半胱氨酸的小结构域(CRD)连接的七跨膜结构域(TMD)[36]。有研究通过基因敲除实验验证了异源二聚体T1R1/T1R3是鲜味的主要受体,而mGluR4则为鲜味的候选受体。早期通过位点突变实验,交换人源鲜味(T1R1/T1R3)和甜味受体(T1R2/T1R3)的VFT构建嵌合体模型,证明了人源T1R1 VFT是配体识别结构域[37],而且仅能够感知L-Glu和5′-IMP。

3.2 呈味机理

当Glu与细胞膜表面的mGluR4受体结合位点结合时,便会产生信号,信号通过受体蛋白质传递,使得细胞膜上面向细胞内部一侧的受体与g蛋白结合,这就表明食物中的鲜味信号已经被接收到,并且引发一系列的生物化学过程:某些离子通道打开,导致细胞膜上的电位下降,从而再次通过神经细胞向大脑发送脉冲信号[38]。

T1R1/T1R3受体的L-Glu结合位点位于T1R1部分,其分子结构与味型mGluR4受体相同,唯一的不同之处就是T1R1/T1R3对鲜度较弱的Asp并不敏感。虽然L-Glu只与受体的T1R1部分结合,但必须保证受体的T1R3部分也同样完整并且和T1R3配对,整个受体系统才能正常工作,传达鲜味信号。研究发现,与鲜味相关的T1R1/T1R3受体复合物对L-Glu的敏感性可以通过5′-IMP和5′-GMP来增强,这也是鲜味协同增效的原因。5′-IMP本身并不激活T1R1/T1R3,但可以与谷氨酸结合后来激活T1R1/T1R3[39]。

T1R1/T1R3的鲜味感知机理如图1。鲜味受体T1R1/T1R3嵌入味蕾感觉细胞的细胞膜中。当VFT与L-Glu结合,便会发出信号,通过TMD结构传导到细胞膜的内部,而此时,细胞膜内部一侧便会有一个g蛋白被绑定。这些活动都发生在鲜味受体T1R1/T1R3的T1R1部分,当L-Glu在VFT弯曲的地方与其结合,会导致VFT的关闭,从而安全地捕获L-Glu分子。另一方面,5′-IMP会附着在VFT边缘的一个地方,增强VFT的捕获能力,使得L-Glu分子与VFT结合地更加牢固,从而使T1R1/T1R3受体对L-Glu更加敏感。然而,如果没有L-Glu,5′-IMP则不能单独刺激鲜味受体T1R1/T1R3,这种效应被称为变构效应[40]。近来有研究表明[41],表现在“捕蝇草结构”上的变构效应有一奇妙的动态特点:当“捕蝇草结构”没有结合L-Glu时,它的动态幅度非常大;当有L-Glu分子与其结合时,它的动态幅度就会明显放缓;而当5′-IMP也与其结合后,它的动态幅度就会变得非常缓慢。可以将鲜味受体T1R1/T1R3的“捕蝇草结构”形象化为“吃豆人”的形态(如图2):当没有L-Glu分子在吃豆人的喉咙里时,他的嘴唇活动非常剧烈;当有L-Glu与他喉咙结合时,嘴唇的运动减慢;当另外一个5′-IMP在他的嘴唇上结合时,嘴唇动态运动完全停止,他就沉默了。另外据研究推测[42],L-Glu与人源T1R1/T1R3的结合位点在T1R1的VFT铰链区深处,而鲜味受体增强剂5′-IMP与VFT铰链区的结合位点靠近VFT开口处,但具体结合位点尚无可知,亟待进一步探究。

图1 T1R1/T1R3的鲜味感知机理Fig.1 Schematic illustration of the umami receptor T1Rl/T1R3

图2 “捕蝇草结构”形象化为“吃豆人”的形态Fig.2 Comparison between the dynamic functioning ofthe Venus flytrap and Pac-Man

4 鲜味的测定

鲜味的检测主要分为两个方面,一方面是定性检测,另一方面则是定量检测。定性检测通常用到的方法有感官评价法和电子舌检测法,而定量方法多种多样,不过多是采用仪器检测代表性鲜味物质的含量后,通过滋味活性值(Taste Active Value,TAV)、味精当量(Equivalent Umami Concentration,EUC)等参数的计算来评价食品的鲜味。本文重点针对鲜味的定量检测方法做以总结。

4.1 感官评价法

感官测试是评估食品味道的主要方法,在测试中,经过专门训练的感官小组会对样本进行评估,并根据感官感受评分判断,最后经过统计分析数据对食品的味道、色泽、气味等特点进行总结性评价和描述。

Suwankanit等[43]运用感官评价的方法,探究了老年消费者对添加天然成分和谷氨酸单钠的熟肉制品的味道(尤其是鲜味)的接受程度和喜爱程度,结果发现添加了谷氨酸单钠的样品并没有特别明显地提高肉制品的鲜味。另外,用感官评价测定食品鲜度的这一方法通常与其他定量方法联用。2016年,Gong等[44]运用感官评价和电子舌的方法对扬子江刀鲚进行了鲜味分析,研究了鲜味相关成分与鲜味之间的关系,通过遗漏测试和添加测试,找到了几种对鲜味贡献最大的几种物质和离子——5′-GMP、5′-IMP、K+、Na+、Cl-和PO43+。

该方法操作相对简单,整个实验过程较为符合实际情况,不需要大型仪器。但由于感官评价者所处的环境和自身条件差异,评价结果存在客观性和重现性差等缺点。

4.2 高效液相色谱法

高效液相色谱又称高压液相色谱,是一种常用的柱层析分析技术,用于混合物各组分的分离、鉴定和定量。高效液相色谱可以用来检测多种氨基酸、核苷酸,包括呈鲜味氨基酸与核苷酸。但由于大多是氨基酸并没有紫外吸收和荧光发射特性,检测器无法有效检测,所以氨基酸需要经过衍生后才能运用液相检测。

王平等[45]以2,4-二硝基氟苯为柱前衍生剂,运用高效液相色谱仪测定了谷氨酸棒杆菌发酵液中17种氨基酸的含量,这17种氨基酸的色谱图分离效果较好且分析范围广,达到0.01～2.00 g/L,对于谷氨酸棒杆菌发酵液的理化性质分析提供了可靠的研究依据。刘登勇等[46]运用高效液相色谱测定了不同卤煮次数的扒鸡卤汤中5′-AMP、5′-IMP、5′-GMP等核苷酸的含量,探究了煮制新汤中核苷酸含量随着煮制次数增加而呈现的变化规律,并探究出了一套检测5′-核苷酸的色谱条件。

运用高效液相色谱检测,分离效率较高,可以同时检测多种鲜味氨基酸及核苷酸,且灵敏度高,仪器可以全自动检测;但高效液相色谱仪价格高昂,且日常维护费用较高,检测耗时很长。

4.3 氨基酸分析仪法

氨基酸分析仪常被应用于分析体液如尿液、血清、血液和食品样品中的氨基酸含量,它是以各氨基酸的溶解度和吸光度不同为原理,对氨基酸进行分离和检测。

Lin等[47]对郫县豆瓣酱中的非挥发性有机酸和氨基酸进行了测定和研究,其中氨基酸的测定就是利用氨基酸自动分析仪来完成的,结果表明,郫县豆瓣酱中含有7种常见有机酸和18种常见氨基酸,其中鲜味代表性氨基酸即L-Glu和Asp含量最高。周聪等[48]利用氨基酸分析仪测定了驯化种植的美味蘑菇中的氨基酸种类和含量,结果表明,鲜味氨基酸总量为5.4312 g/100 g,另外必须氨基酸占比较高,能够充分证明这种蘑菇味道鲜美、营养价值很高。Sato等[49]对日本西南部冲绳县不同性别的椰子蟹中的游离氨基酸、核苷酸相关化合物和脂肪酸进行了测定、分析和比较,其中对于游离氨基酸的检测是通过氨基酸分析仪完成的。

氨基酸分析仪不仅能够准确检测出呈鲜味氨基酸的种类和含量,还能检测其他各种类型的氨基酸,是如今较为常用的定量检测氨基酸的方法,但是氨基酸分析仪对于样品的纯净度要求较高,样品预处理较为复杂,且氨基酸分析仪价格昂贵,保养维修成本高。

4.4 生物传感器法

近年来,有人将人类味觉感受器与以纳米材料为基础的传感器相结合制成生物传感器,具有极佳的味觉测量性能。生物传感器是以电化学工作站为检测仪器,通过在工作电极上修饰酶制剂或者生物性物质来实现对特定物质的检测。

2016年,Ahn等[50]开发出了一种含有味觉感受器的纳米囊泡的双电子舌(DBT)。以人胚胎肾293(HEK-293)细胞为基础,通过基因的转载表达培育能够稳定表达味觉受体的细胞,再从这些细胞上分离出带有鲜味受体T1R1/T1R3和甜味受体T1R2/T1R3的的纳米囊泡,然后将这些纳米囊泡固定于石墨烯表面,从而制成双生物电子舌。双电子舌可以同时检测鲜味和甜味物质,可在低浓度(约100 nmol/L)下对目标试剂进行高度敏感和选择性识别。此外,它还能够像在人类味觉感官系统中一样检测到鲜味的协同增效作用。2018年,这个团队又在之前实验和研究的基础上,开发出一种直接以鲜味受体T1R1/T1R3上的捕蝇草结构(VFT)为基础的生物电子舌[51]。它显示出很高的灵敏度,与人类味觉系统相似,可以连续5周保持90%以上的正常信号强度,具有批量生产、可重复使用、稳定性好等优点。

另外Huang等[52]在2018年将鲜味受体hT1R1安装固定在玻碳电极表面,测量了四种呈鲜味物质(L-谷氨酸单钠(MSG)、5′-IMP、5′-GMP和琥珀酸二钠(SUC))的响应电流。采用传感动力学方法计算了受体与配体相互作用的变构常数,结果表明,hT1R1对四种配体的感应能力为:GMP>MSG>IMP>SUC。发现hT1R1本质上是氮信号的识别受体,可能通过其氨基识别鲜味物质。本研究开发的新方法在信号转导机制研究和药物筛选方面具有广阔的应用前景。才英明[53]运用氧化石墨烯与氯金酸、壳聚糖、上,组成工作电极,辅以Ag/AgCl电极作为参比电极、铂丝电极作为对电极,运用循环伏安法对牛肉中谷氨酸含量进行检测,结果表明,此法测得的结果与氨基酸分析仪法对谷氨酸的检测结果相近,具有高特异性、灵敏性及可重复利用性。

4.5 电化学传感器法

电化学传感器是利用电化学反应原理,将无机或有机的化学物质固定在工作电极上,搭配以参比电极和对电极,记录工作电极上的敏感物质与待测电解液的反应电流、电势变化,这一系列变化就可以反应待测电解液中的某种物质的浓度。

2019年,朱灵涛[54]选择N,N-二苯基硫脲(N,N′-Diphenylthiourea DPTU)作为鲜味敏感物质,研制了DPTU/PVC/PPy/Pt的膜修饰贵金属传感器。通过开路电位法对待测电解液中的Glu和Asp含量进行检测,构建了开路电位值与呈鲜味氨基酸含量的数学模型,实现了对溶液中的Glu和Asp含量的准确检测。

5 结语

本文以鲜味为出发点,介绍了不同食物中含有的不同鲜味物质,简述了当前鲜味的提取方法,即传统酵母提取法和现如今较为新颖的动物骨肉残渣酶解、热提取法。到目前为止,鲜味感知并没有统一的分析理论,但已发现的鲜味受体包括异源二聚体 T1R1/T1R3 与味型代谢性谷氨酸受体mGluR4 两种,其中T1R1/T1R3受体与L-Glu、5′-IMP的结合也解释了鲜味的协同增效机制。另外,鲜味的检测方法可分为两大类:以感官评定和电子舌检测为代表的定性检测,以氨基酸分析仪、高效液相色谱仪等为代表的定量方法,本文对几种常见的鲜味检测方法做了简要总结,并重点介绍了近几年比较新颖的生物传感器法和电化学检测法,为鲜味的测定及食品风味的评价提供较为新颖的参考方法。

在进行鲜味物质检测时,定性检测结果较为宏观,无法进行不同鲜味物质间的含量对比。而定量检测中的常用方法多需使用昂贵的大型仪器,对于不同种鲜味物质的检测方法有所差异,导致检测时间较长。而现如今较为新颖的电化学及生物传感器检测方法既准确又省时,检测不同鲜味物质的电化学和生物传感器可以组成传感器矩阵,能够对各种鲜味物质进行同时、快速、准确检测,这也是如今鲜味检测领域亟需拓展的一个热门领域和发展方向。