关于痛风性关节炎病证结合动物模型的思考

章晓云，顾 兵，陈玉年，李华南

(1.江西中医药大学临床医学院，江西 南昌 330004；2.广西中医药大学附属瑞康医院骨科，广西 南宁 530011；3.江西科技师范大学药学院，江西 南昌 330013)

痛风性关节炎(gouty arthritis，GA)是一种由尿酸排泄障碍引起的炎性疾病，以高尿酸血症、痛风石、关节畸形等为临床特点，病情反复、迁延难愈，好发于40岁以上男性[1]。随着人们饮食结构的改变和生活水平的提高，GA发病率呈逐年上升且低龄化趋势[2]，其急性与长期反复发作严重影响人们的生活质量。因此，建立一套科学的模型体系对开展GA实验研究至关重要。目前，国外对GA研究侧重于病理机制，以非甾体抗炎药、秋水仙碱、糖皮质激素等药物进行对症治疗，但存在许多毒副作用和禁忌症。而国内倾向于将GA中医证候与西医病理相结合，即病证结合，这是现今中医药研究领域的重要模式。通过构建GA病证结合动物模型，并形成完整的证候量化指标评价体系，这对于深入探讨GA中医证候本质、发病机制及中医药的临床应用具有重要意义。本文从中西医临床两方面对疾病的认识出发，总结GA病证结合动物模型构建过程中存在的问题，阐述不同证候潜在有效的量化指标，为筛选标准的符合临床中医证候动物模型提供科学依据。

1 痛风性关节炎的发病机制

1.1 现代医学对GA发病机制的认识目前，对于GA发作与缓解的具体分子机制尚未明确，但普遍认为由尿酸钠盐晶体诱发自身免疫所介导的炎症反应是GA急性发作的主要诱因，炎症细胞、细胞因子、免疫球蛋白及相关受体等已成为GA发生、发展和缓解过程中的关键因子。研究认为[3]，其病理机制由巨噬细胞和中性粒细胞介导，尿酸钠盐晶体刺激滑膜细胞、单核-巨噬细胞和嗜中性粒细胞，诱导产生多种炎症趋化因子和激活因子，进而诱发炎症反应。嗜中性粒细胞在关节组织中聚集、浸润及活跃后吞噬尿酸钠晶体，并随细胞膜的溶解释放出炎性细胞因子，激活自由基，从而进一步增强炎症反应，最终出现急性GA典型症状。多数患者临床表现为发作与缓解交替出现，病程长者发作期长，而缓解期短，甚至迁延难愈。在急性GA炎症反应的自发缓解过程中，中性粒细胞胞外诱捕网通过激活免疫系统吞噬炎症相关因子发挥了重要的作用，同时还参与慢性GA中痛风石的形成。

1.2 中医学对GA发病机制的认识中医学将痛风归于痹症，首见于《内经》。《素问·痹论篇》中记载“风、寒、湿三气杂至，合而为痹”，将其病机归纳为风寒湿邪滞留。“由饮酒腠理开，汗出当风所致也。亦有血气虚，受风邪而得之者。风历关节，与血气相搏交攻，故疼痛。血气虚，则汗也。风冷搏于筋，则不可屈伸，为历风关节也”则进一步表明其病因病机为血气虚与风寒湿搏结于筋脉所致。《诸病源候论·风病诸候》中亦记载“历节风之状，短气，自汗出，历节疼痛不可忍，屈伸不得是也”，表明GA的临床症状以关节疼痛、屈伸不利为主。李君霞等[4]认为GA多有饮酒及喜食膏粱厚味的习惯，其病机为脏腑升清降浊功能丧失，湿浊瘀滞内阻，痰湿阻滞经脉而发病，创立浊瘀痹。邓运明等[5]指出GA病位在中焦脾胃，病机以脾胃失和为本，湿热痹阻为标，其与普通痹症不同之处在于GA每次发作均与饮食不节有关。总结古今中医各家学说发现，GA基本病机为饮食不节，外感风寒湿热等淫邪，致机体寒热失调，三焦运化失职，津液代谢失常，湿聚成痰，痰血相容以致痰浊瘀阻，痰瘀内阻以生热毒，滞于四肢关节筋脉，进而引起局部肿痛，久病累及肝肾诱发诸症。

2 痛风性关节炎的诊断标准及临床特征

2.1 痛风性关节炎现代医学诊断标准及临床特征GA现代医学诊断主要参考美国风湿病协会1977年制定的标准和《实用骨科学》第四版[6]，其诊断主要取决于疾病的临床症状，组织病理学特征，血液或关节液生化指标三方面。将临床症状列为核心指标，共4项；组织病理学特征列为主要指标，共5项；血液或关节液生化指标列为次要指标，共3项。符合核心指标1项为11%，主要指标及次要指标一项为7%，总分值100%，详见Tab 1。

2.2 痛风性关节炎中医学诊断标准及临床特征GA中医学诊断参照国家中医药管理局出版的《中医病症诊断疗效标准》[10]，结合病因病机与辨证，可将其证型分为湿热蕴结、瘀热阻滞、疾浊阻滞及肝肾阴虚型，各临床表现详见Tab 2。其中以急性期为主的湿热蕴结型最常见，其次是以慢性缓解期为主的痰浊阻滞和肝肾阴虚型。根据Tab 2进行归纳总结，不同证型GA的临床共同主症有:① 关节肿痛不适，活动量减少；② 关节活动受限，屈伸不利；③ 精神不振；④ 食欲减退。次症主要有：① 发热口渴；② 腹胀纳呆；③ 行动呆滞；④身困倦怠；⑤毛发色泽改变。符合主症1项为15%，次症一项为8%，总分值100%。

Tab 1 Classification of clinical performance indexes of gouty arthritis in modern medicine

Tab 2 Clinical manifestations of different TCM syndromes of gouty arthritis[11]

Tab 3 Degree of agreement between different types of animal models and clinical syndromes of gouty arthritis

3 GA动物模型的研究现状分析

目前在GA中医药实验研究中，已构建出症状、病因、病理以及病证结合四种动物模型[1，11-19]，涉及模型动物主要有禽类动物和哺乳类动物，其中禽类动物主要有鸡、鹌鹑，哺乳动物主要有鼠和兔。但无论是何种品系，何种性别的实验动物，它们对不同的造模因素都会存在耐受性和敏感度不一样，即使是同样的造模因素对于不同品系，不同物龄的实验动物也存在差异。实验动物的体质与人不完全一致，有时候动物模型建立后虽然各项指标符合GA及相应证型的临床症状，但是动物模型体内的生理病理可能已经发生了很大变化。对于GA病证结合动物模型的建立，应根据中医辨证施治，结合GA疾病特点与模型动物自身特性进行综合选择，从而复制出满足实验要求的动物模型。

通过对各模型的构建方法、动物选择、模型特点与临床应用价值进行评价，并根据上述中医学与现代医学对GA诊断标准及临床特征各项指标进行赋值，分析各模型与GA中西医临床吻合度(Tab 3)。结果显示症状模型无论是中医吻合度还是西医吻合度均较低，这可能是由于该模型在实验动物体内未形成高血尿酸，只能模拟出GA某些症状，不适用于尿酸结晶沉积致炎的过程研究，而且并不能体现不同证候的症状及发病机制。病理模型的西医吻合度比中医吻合度明显较高，可能是由于该模型虽然模拟出GA病理学特征—高尿酸血症，但并未针对GA中医本质及不同证型特征进行复制，无法建立与中医证候之间的联系。病因模型的中西医吻合度较症状模型及病理模型均较高，可能与该模型构建因素符合GA发病诱因，而且符合GA的病理学特征有关。但GA中医病因中存在诸多非特异性因素，从而限制了单一造模因素在GA证候研究中的应用。基于此，近年来逐渐开始采取多因素模式建立GA病证结合动物模型，该模型的中西医临床吻合度均明显高于以上三种模型，尤其是中医吻合度高达92%。因此，未来应综合多种因素，以更加合理的方式进行病证结合动物模型的构建。

4 GA病证结合动物模型的意义

根据不同医学体系对GA病证的理解，中医擅长辨证，西医擅长辨病，病证结合研究不仅体现了中医辨证论治，同时也体现了西医对GA发病机制及病理变化的认知。近代发展起来的病证结合动物模型通过研究GA生理病理改变，从分子水平进行中医理论验证，这对于探讨GA生理病理改变与中医不同证候特征之间的关系极具意义，从而使中医学实验研究开展更贴近临床。通过构建不同证候动物模型进行GA基础研究，为进一步验证GA发病本质、揭示GA辨证论治基本规律奠定基础。病证结合动物模型可避免一定研究期限内存在样本量不足的窘况，而且可通过严格控制实验条件，使动物模型复刻人体GA不同证型特征，提高实验结果对临床的指导意义；通过实时观察处于不同阶段动物模型的证候特征，并检测相关生物学及病理学指标，以利于GA发病机制特异性指标的筛选，从而提高人们对GA本质的全面认识。建立切实可行的病证结合动物模型评价体系，有助于为临床药物治疗GA生物学参数提供参考依据。

5 GA病证结合模型评价体系的建立

结合前人关于病证结合动物模型的研究，笔者认为病证结合动物模型的构建应在GA动物病理模型基础上，观察动物宏观及微观表征参数，当这些参数基本符合或完全符合人体不同证候GA的诊断依据时，则可认为模型建立成功。如何对不同证候模型动物的表征参数进行量化，并通过客观指标评价模型构建成功与否是病证结合动物实验研究的关键问题。

5.1 宏观中医证候评价指标根据上述中西医对GA诊断标准及临床特征的分析可知，症状和体征在中医证候的临床诊断中起着关键作用，因此动物模型证候明确与分辨也应基于此。由于动物与人体存在差异，它们无法通过语言表达内心情绪，动物模型很难体现GA患者的很多中医证候特点，尤其是主症和次症的区别，同时需考虑舌脉象在动物模型上的体现。临床上无法根据中医的望闻问切四诊进行症状与体征的采取，限制了临床中医证候评价系统在动物模型中的使用。但我们在进行GA病证结合动物模型的研究中，应加强挖掘动物与人类之间具有相似性的自身特征，借助心电图，数码照相等现代手段对模型动物的舌脉象、证候表现进行采集，通过称重和喂食量客观测量体重、饮水量及进食量，通过观察动物的精神状态、步态、大小便情况，测量关节肿胀程度，足掌或者肛周温度等症状体征，从而逐步实现四诊指标的客观化、标准化，并将其应用于中医证候研究中。

5.2 微观病理生化评价指标当GA不同证型模型动物在外观上无明显变化时，微观生化病理指标则显得尤为重要。对模型动物进行辨证区别时，微观生化病理指标比宏观症状与体征更敏感，可靠。GA病证结合动物模型首先应符合GA疾病的病理改变，根据现代医学对GA诊断标准及临床特征分析结果可知，用于GA反应“病”模型的微观生化指标主要有：评价炎症反应及程度相关指标：IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、白细胞、中性粒细胞、CRP、ESR等[7,9,20]；评价血脂代谢指标：TG、TC、HDL-C、LDL-C[8]；评价肝功能损伤相关指标：ALT、AST、GGT；评价肾功能相关指标：血尿酸、肌酐、肌酐，尿素，尿素氮[7,9]。另有研究证实，GA炎症反应的自发缓解与中性粒细胞胞外诱捕网有关[21]，其中中性粒细胞弹性蛋白酶、髓过氧化物酶及组蛋白等蛋白酶发挥着关键作用。中性粒细胞受到刺激后，发生染色质解聚、核膜崩解，形成一种以细胞核游离DNA为基本骨架的网状结构，即中性粒细胞胞外诱捕网。它可吞噬与降解IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子，提高机体对炎症的免疫防御能力，促进GA病情缓解。结果还显示现代医学评价GA的主要指标为组织病理学指标，炎症反应发生时，病变关节内滑膜明显增生，局部充血水肿，关节周围形成异物肉芽肿，其间还伴有大量异物多核巨细胞、成纤维细胞及毛细血管增生，部分动物关节腔内可见尿酸钠盐结晶析出，导致软骨被破坏，从而形成局部红、肿、热、痛的病理生理效应。因此可同时结合镜下观察关节软骨、滑膜及周围软组织的病理变化，可进一步评估关节破坏程度。

“病”模型可通过微观生化病理指标检测进行评价，但不同证候的诊断尚未有明确的实验室诊断标准。当中医“证”在症状体征上无明显差别时，实验室指标则显得尤为重要。在进行GA病证结合动物模型的过程中，我们应基于GA“病”模型基础上，进行不同证候的微观生化病理指标检测(Fig 1)。研究表明血脂代谢异常与“湿”关系密切，是湿热蕴结型动物的病理特征之一[22]。另有研究发现，血脂代谢异常还与痰湿存在密切的联系，血脂是痰浊形成的物质基础之一[23]，这与中医学观点“湿与热结，炼液为痰”的观点相符。高脂饮食是GA主要诱因，可直接导致血脂代谢异常，李艳等[24]研究表明高脂饮食可明显降低肠道乳酸、双歧杆菌和肠杆菌活性。因此血脂代谢相关指标(LDL-C、HDL-C、TG及TC)以及由其引起的肠道菌群及肠道乳酸水平变化可作为湿热蕴结与痰浊阻滞型的特异性量化指标。痰血相容以致痰浊瘀阻，影响血管舒缩，导致血管无法正常散热而出现发热症状。机体血管舒缩主要通过降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptid，CGRP)与内皮素(endothelin，ET)之间相互拮抗进行调控，病程长短可影响两者的合成与释放[25]。血管舒缩可进一步激活血小板功能，而血栓素(thromboxane，TX)A2是血小板活化程度的特异性指标，结构稳定性较差，可迅速转为稳定的TXB2，后者具有血小板凝聚及血管收缩作用，与前列腺素相拮抗，两者动态平衡可调节血管收缩功能及血小板聚集作用[26-27]。血管收缩及血小板聚集会影响机体血液流变学的改变，导致络脉瘀阻，瘀血阻络，血不循常道而溢出脉外，符合瘀热阻滞型的病理改变。因此CGRP、ET、TXB2和前列腺素等影响血管舒缩功能的相关性指标以及血液流变学指标可作为瘀热阻滞型的特异性量化指标。痰瘀内阻以生热毒，滞于四肢关节筋脉，进而引起局部肿痛，久病累及肝肾。中医学关于GA疾病的认识也表明肾虚为发病之本，现代医学也常以性激素作为肾虚证的评价指标，故以雌二醇(estradiol，E2)、雌二醇/睾酮比值(estradiol/testosterone，E2/T)的水平可作为肾气盛衰的表现。GA肝肾阴虚证常见头晕耳鸣、颧红口干、便秘、舌红少苔等临床症状，与交感神经兴奋相似，亦有研究证实肾阴虚患者可出现交感神经兴奋，而且与血清单胺氧化酶(monoamine oxidase，MAO)、全血乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase，AchE)两者水平变化密切相关[28]。血清MAO活性与E2水平负相关[29]，而AchE活性与E2水平呈正相关[30]，故当血清MAO升高，AchE降低时，可抑制E2的表达，加重肝肾阴虚型GA患者的临床症状。因此性激素及影响交感神经兴奋的相关指标可作为肝肾阴虚型的特异性量化指标。

Fig 1 Microscopic pathology and biochemical indexes of different TCM syndrome animal models of gouty arthritisNotes：↑ ：Represents the increase of corresponding index level or activity;↓：represents the decrease of corresponding index level or activity

综上所述，构建GA病证结合动物模型应从中医基本理论出发，复合环境、饮食、生物因子等因素综合模拟GA发病环境，吻合临床发病特征，将西医的“病”与中医的“证”相结合，有助于为临床治疗提供可靠的参考价值。其评价体系的建立，以血尿酸、肌酐及肝功作为GA病理基础的量化指标；以IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等指标评价炎症反应及程度。对于湿热蕴结型与痰浊阻滞型模型动物更应注重血脂代谢的改变，检测LDL-C、HDL-C、TG及TC等相关指标，同时检测肠道菌群及肠道乳酸水平；对于瘀热阻滞型应注重检测与血管舒缩有关的ET、CGRP、TXB2与前列腺素等相关指标以及血流变学指标；对于肝肾阴虚型可检测性激素及影响交感神经兴奋的相关指标。