检测猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪圆环病毒的二重荧光LAMP方法的建立

谢志勤，张民秀，谢芝勋，范晴，罗思思，谢丽基，黄娇玲，王盛，曾婷婷，张艳芳，李孟，李丹，邓显文，刘加波

(广西兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，南宁 530001)

猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome viruses，PRRSV)引起的猪一种急性传染病，俗称猪蓝耳病，病猪表现为食欲不振，体温升高，以耳跟和腹部发红为明显特征，发病率和死亡率极高，该病对猪的危害性极大，引起极大的经济损失[1-2]。猪圆环病毒病(porcine circovirus disease,PCVD))是由猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2,PCV2)引起的猪一种传染病，病猪以早期淋巴结肿大，食欲不振，呼吸困难，腹泻，早产及死胎等为特征，发病率20%～60%和死亡率5%～35%[3-5]。PRRSV和PCV2可同时引起猪致病，临床上常有PRRSV和PCV混合感染的报道[6-10]，而且两种病引起猪的临床症状有时很相似，共同的症状表现为体温升高、急性死亡、怀孕母猪流产或死胎等，单靠临床诊断很难作出判断，需要借助实验室才能进行确诊。目前实验室诊断这两种病的方法常见的有病原分离鉴定[11-13]、PCR方法[14-20]、荧光定量PCR方法[21-23]、ELISA方法[24-25]、LAMP方法[26]和GeXP方法[27]等，这些方法都各有优点与缺点。本研究建立一种检测PRRSV和PCV的二重荧光LAMP方法，可直接通过观察反应颜色来判断结果。

1 材料与方法

1.1 所用仪器和实验试剂 Loopamp度仪：日本荣研公司产品(型号Loopamp LA-320C)；核酸测定仪:美国ThermoFisher Scientific公司产品(型号NanoDrop 2000)；多色荧光成像分析系统：美国BIO-RAD公司产品；LAMP 试剂盒购自荣研生物科技(中国)有限公司产品(批号8Y007)；Bst 3.0 DNA/RNA 聚合酶购自NEB 公司(New England Biolabs Inc.Catalog# M0374)；RNA/DNA提取试剂盒和质粒小量提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；premixTaq PCR试剂盒和PMD-20T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 试验用毒株 猪繁殖与呼吸综合征毒株 CH-1R(美洲型)购自哈尔滨维科生物技术开发公司，猪圆环病毒2 BH5 株(PCV2 BH5)由广西壮族自治区兽医研究所保存提供。对照用的毒株：猪口蹄疫O型灭活疫苗(Food and mouth Disease Virus,FMDV O型)购自兰州兽医研究所，猪细小病毒 (Porcine Parvovirus,PPV)、猪日本乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus,JEV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)、猪布氏杆菌2号(Brucellasuis,BS2)、猪链球菌2型(Streptococcussuis,SS2)由广西壮族自治区兽医研究所保存提供，猪瘟兔化弱毒株(C株)由广西丽原生物股份有限公司提供，猪瘟毒株石门株(F114)购自中国兽医药品监察所。

1.3 设计引物和探针 根据Genebank上发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2基因(登录号：MF772778.1)和猪圆环病毒 ORF2基因(登录号：KY947578.1)序列保守区域，通过MEGA 5.0 在线比对分析，然后用 primer premier 5.0和Primer explore V4软件分别设计了2套用于LAMP特异性扩增的引物及探针。特异性引物包括外引物F3和B3，内引物FIP(FIP=F1c+F2)和BIP(BIP=B1c+B2)。设计的探针序列介于F1c和B1c之间，并且在探针的两端分别标记荧光基团和淬灭基团。PRRSV-Probe 探针的5’端标记荧光基团FAM，3’端标记了淬灭基团BHQ1，在520 nm波长通道下，游离的FAM荧光基团会激发出绿色荧光。PCV-Probe 5’端标记荧光基团Cy5.5，3’端标记淬灭基团BHQ2,在690 nm上下波长通道下，游离的Cy5.5荧光基团会激发出红色。引物由大连宝生物公司合成,HPLC级纯化,引物序列见表1，引物设计位置示意图见图1。

图1 PRRSV和PCV2 引物设计位置示意图

1.4 病原核酸提取 按照RNA/DNA提取试剂盒说明书要求步骤进行病原核酸的提取，首先吸取250 μL 病毒液或经处理的临床样品上清液至1.5 mL离心管中，加入裂解液200 μL和蛋白酶K 20 μL混合，然后按步骤进行病原RNA/DNA提取，最后加TE洗脱缓冲液25 μL离心洗脱RNA/DNA，分装放-80 ℃保存备用。

1.5 反应标准模板的制备 将提取PRRSV CH-1R的RNA反转录成 cDNA,然后用PRRSV外引物(PRRSV-B3，PRRSV-F3)扩增反转录后的cDNA模板，扩增产物片断大小约为228 bp。同样，用PCV外引物(PCV-F3，PCV-B3)扩增PCV2 BH5的DNA模板，扩增产物片断大小约为324 bp。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳切胶回收，与PMD-20T载体连接转化感受态细胞DH5α，经PCR和双酶切鉴定重组菌，用质粒小量试剂盒提取培养的阳性重组菌中的质粒。用NanoDrop 2000测定提取质粒的浓度，然后按公式计算换为拷贝数：拷贝数(copies/μL)=6.02×1023/660×3000×10-9×质粒浓度(g/μL)。将等量的两种模板按不同浓度进行配比或按梯度进行稀释混合，制备标准模板保存于-70 ℃备用或直接应用。

1.6 二重荧光LAMP反应的建立 将制备的PRRSV CH-1R和PCV2 BH5标准质粒模板，按不同的浓度进行配比混合，然后加入二重荧光LAMP反应体系，并对反应体系中引物浓度、探针浓度及退火延伸温度范围进行优化，优化的引物浓度、探针浓度及温度范围如下：内引物5～60 pmoL/μL，外引物1～20 pmoL/μL，探针0.1～1 pmoL/μL，退火和延伸温度范围60～68 ℃。

1.7 LAMP结果判定 将反应产物取出，置多色荧光成像分析系统中，选择520 nm和690 nm荧光通道下显色，在520 nm荧光通道下，PRRSV标准样品呈绿色，PCV标准样品及阴性对照样品为无色。在690 nm荧光通道下，PCV标准样品呈红色，PRRSV标准样品及阴性对照样品为无色。在520 nm和690 nm共同荧光通道下，同时含有PRRSV和PCV标准混合样品呈黄色，阴性对照样品为无色。在以上荧光通道样品成立的情况下，根据颜色判断检测样品结果，结果直观准确，容易判断。

1.8 二重LAMP特异性测试 提取PRRSV CH-1R 的RNA 和PCV2 BH5 的DNA,对照毒株CSFV C、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2 的RNA或DNA，并测定其浓度，用建立的方法对这些核酸进行二重荧光LAMP扩增检测，验证本方法的特异性。

1.9 二重LAMP敏感性和干扰性测试 将制备的PRRS CH-1R和PCV2 BH5毒株的标准模板测定浓度，根据浓度换算为拷贝数，然后作10倍梯度稀释为1×107～100拷贝/μL，将各梯度相同拷贝浓度的PRRSV和PCV 核酸等体积混合，利用本实验建立的二重荧光LAMP方法对PRRSV和PCV 混合模板进行测试，检验本方法的最低检出的拷贝数。同样，将不同拷贝浓度的PRRSV和PCV 核酸交叉两两等体积混合，利用本实验建立的二重荧光LAMP方法对PRRSV和PCV 混合模板进行测试，检验不同的模板浓度对本方法的干扰性。

1.10 临床样品检测验证 采集来自广西不同地区不同猪场的患病猪的临床样品93份，这些样品包括肺组织41份和淋巴结52份。提取肺组织及淋巴结组织中病毒核酸：取适量的肺组织、淋巴结分别进行研磨，按1∶5加入灭菌的磷酸盐缓冲溶液(PBS)继续研磨匀浆，吸取1.5 mL匀浆放入到2 mL EP管中，-70 ℃反复冻融 3次，3000 r/min 离心5 min，吸取上清液250 μL按RNA/DNA提取试剂盒说明提取核酸，然后用本实验建立的二重荧光LAMP进行扩增检测，同时用已建立的PRRSV和PCV荧光定量PCR方法作对比检测,扩增阳性PCR产物送生物公司进行测序测定，以验证本方法建立的二重荧光LAMP的准确性。

2 结果与分析

2.1 二重LAMP方法的建立 将制备的PRRSV CH-1R和PCV2 BH5标准质粒模板加入到二重荧光LAMP反应，反应体系为25 μL，经优化后的最佳反应试剂如下：2×LAMP buffer 12.5 μL(日本SIGMA Tokyo公司产品，内含100 mM KCl，200 Mm pH 8.8的Tris-HCl，100 mM (NH4)2SO4，80 mM MgSO4，8M betaine，1% Tween-20，14 mM dNTPs)，Bst3.0 DNA/RNA 聚合酶320 U，40 pmoL/μL内引物PRRSV-FIP、PRRSV-BIP、PCV-FIP和PCV-BIP各1 μL(工作终浓度分别为1.6 pmoL)，5 pmoL外引物PRRSV-F3、PRRSV-B3、PCV-B3和PCV-F3各1 μL(工作终浓度分别为0.2 pmoL)，0.5 pmoL探针PRRSV-Probe和PCV-Probe各1 μL(工作终浓度分别为0.02 pmoL)，模板 2 μL，用灭菌超纯水补足25 μL。将各试剂轻轻混合，然后置Loopamp浊度仪或恒温水浴锅。经优化后最佳的退火延伸温度为62 ℃，反应90 min，85 ℃ 5 min结束反应。获得的结果见图2。图2中A为520 nm荧光通道下，含有PRRSV CH1R样品的1管和3管呈绿色，含有PCV2、对照水及CSFV C株的2管、4管和5管呈无颜色。B为690 nm荧光通道下，含有PCV2 BH5样品的2管和3管呈红色，含有PRRSV CH1R、对照水及CSFV C株的1管、4管和5管呈无颜色。C为520 nm和690 nm共同荧光通道下，含有PRRSV CH1R样品的1管呈绿色，含有PCV2 BH5样品的2管呈红色，同时含有PRRSV CH1R和PCV2 BH5样品的3管呈黄色，含有对照水及CSFV C株的4管和5管呈无颜色。

2.2 特异性测试结果 用建立的方法对PRRSV和PCV毒株以及对照用的毒株的核酸进行扩增，结果本方法只扩增出PRRSV和PCV毒株，参试的对照毒株CSFV C、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2 没有呈现任何颜色，即对照毒株没有扩增。PRRSV与PCV毒株间没有交叉颜色变化，具有良好的特异性，结果见图3。图3中A为520 nm荧光通道下，含有PRRSV CH1R样品的1管和3管呈绿色，含有PCV2 BH5、CSFV C株、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的2管、4管至10管呈无颜色。B为690 nm荧光通道下，含有PCV2 BH5样品的2管和3管呈红色，含有PRRSV CH1R、CSFV C株、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的1管、4管至10管呈无颜色。C为520 nm和690 nm共同荧光通道下，含有PRRSV CH1R样品的1管呈绿色，含有PCV2 BH5样品的2管呈红色，同时含有PRRSV CH1R和PCV2 BH5样品的3管呈黄色，含有CSFV C株、FMDV O型、PPV、JEV、PRV、BS2、SS2的4管至10管呈无颜色。

2.3 敏感性测试结果 用本方法对制备的标准模板浓度分别为1×107～100拷贝/μL进行检测，结果显示本方法最低能检测出100个拷贝的PRRSV和PCV混合模板浓度，结果见图4。图4中A为520 nm荧光通道下，1管至6管分别为107～102拷贝/μL的PRRSV和PCV2混合模板标准品，呈绿色，7管和8管为101～100拷贝/μL的PRRSV和PCV2混合模板标准品，呈无色。B为690 nm荧光通道下，1管至6管分别为107～102拷贝/μL的PRRSV和PCV2混合模板标准品，呈红色，7管和8管为101～100拷贝/μL的PRRSV和PCV2混合模板标准品，呈无色。C为520 nm和690 nm共同荧光通道下，1管至6管分别为107～102拷贝/μL的PRRSV和PCV2混合模板标准品，呈黄色，7管和8管为101～100拷贝/μL的PRRSV和PCV2混合模板标准品，呈无色。

2.4 干扰性测试结果 将PRRSV CH-1R和PCV2 BH5 标准模板按不同浓度进行组合，制备不同模板浓度的混合样品，用建立的方法进行检测，不同模板浓度的混合样品如下：样品1(107PRRSV+101PCV)，样品2(106PRRSV+102PCV)，样品3(105PRRSV+103PCV)，样品4(104PRRSV+104PCV)，样品5(103PRRSV+105PCV)，样品6(102PRRSV+106PCV)，样品7(101PRRSV+107PCV)。结果当两个模板浓度不同时，尤其是一个模板浓度高，另一个模板浓度低时，本方法仍然可鉴别检测到不同的两个模板，即不同的模板浓度对本方法干扰性小，结果见图5。图5中A为520 nm荧光通道下，1管至6管的样品1、样品2、样品3、样品4、样品5、样品6呈绿色，7管的样品7呈无色。B为690 nm荧光通道下，2管至7管的样品2、样品3、样品4、样品5、样品6、样品7呈红色，1管的样品1呈无色。C为520 nm和690 nm共同荧光通道下，1管的样品1呈绿色，7管的样品7呈红色，2管至6管的样品2、样品3、样品4、样品5、样品6呈黄色。

(1.PRRSV CH1R;2.PCV2 BH5;3.PRRSV CH1R和PCV2 BH5;4.对照水;5.CSFV C株,A为520 nm荧光通道图；B为690 nm荧光通道图；C为520 nm和690 nm荧光双通道图)

(1～8.107～100拷贝/μL(PRRSV和PCV2混合模板标准品，A为520 nm荧光通道图；B为690 nm荧光通道图；C为520 nm和690 nm荧光双通道图)

(样品1(107PRRSV+101PCV)，样品2(106PRRSV+102PCV)，样品3(105PRRSV+103PCV)，样品4(104PRRSV+104PCV)，样品5(103PRRSV+105PCV)，样品6(102PRRSV+106PCV)，样品7(101PRRSV+107PCV)。A为520 nm荧光通道图；B为690 nm荧光通道图；C为520 nm和690 nm荧光双通道图)

2.5 临床样品验证 用本实验建立的二重荧光LAMP方法对临床样品93份进行检测，检测结果PRRSV阳性样品12份，检测阳性率为10.7%，PCV阳性样品8份，检测阳性率为7.14%。同时为PRRSV和PCV阳性样品5份，即为混合感染样品，混合感染率为 5.38%，这一结果与荧光定量PCR方法检测结果一致。检测的所有阳性样品产物送生物公司测序，测序结果经序列比对分析全为对应病毒。

3 讨论与结论

新型LAMP检测方法是Notomi等于2000年首先建立，该方法是采用恒温进行扩增，操作较简便，成本低，随后被应用于各类疫病的检测中[28-29]。随着技术研究的进步，已成功建立了基于多种颜色的二重LAMP方法，一次扩增能有效区分鉴别二种病原体[30]。本研究根据二重LAMP的特点，在FIP与BIP引物之间设计插入了一条Taqman 探针，在探针的5’端标志不同的荧光基团，在3’标志有淬灭基因。探针本身并不会发光，当加入 LAMP反应中，探针序列结合到模板序列上，随着内外引物特异性结合延伸，迫使与模板结合的探针断裂，荧光基团与淬灭基团断开，荧光基团成为游离基团，这样游离的荧光基团在没有淬灭基团淬灭的情况下发出荧光。本研究采用的FAM荧光基团，在波长520 nm荧光通道下，游离的FAM荧光基团激发绿色，在波长690 nm荧光通道下，游离的CY5.5荧光基团激发红色。本研究通过反应后颜色的不同来区分不同的病毒，并获得成功。

本方法的成功建立，还与反应中引物浓度、探针浓度及反应试剂、程序的优化分不开。为了获得稳定的最佳的扩增效果，本研究对反应的引物浓度、探针浓度及反应试剂、程序进行了优化。在引物浓度和探针浓度的优化中，发现内引物浓度用量最高，其次为外引物浓度，探针浓度用量最低，它们之间的浓度应用比约为80 ∶10 ∶1。最佳反应程序为：退火延伸温度62 ℃，反应时间90 min，85 ℃ 5 min结束反应。应用优化后的引物浓度、探针浓度、反应试剂及程序，获得了最佳的LAMP扩增效率。

本研究中采用Bst 3.0 DNA/RNA 聚合酶进行二重荧光LAMP扩增，该酶与Bst 2.0 DNA 聚合酶和Bst DNA 大片段聚合酶相比，具有更佳的延伸能力活性、更强的逆转录活性以及强烈的链置换活性，不需要预先对RNA模板单独进行逆转为cDNA。应用该酶、LAMP试剂及本研究的引物组进行扩增，一次加模板就能完成LAMP扩增，简化检测工序，缩短时间，大大降低因操作而引起的污染。

由于LAMP扩增比较敏感，很容易受空气中气溶胶的污染。本研究中反应结束后直接通过仪器读取或凭肉眼对反应结果进行判定，不需要通过电泳或打开反应盖添加染料，这样极大地降低了LAMP的污染，确保样品检测的准确性。另外，本研究建立的方法，在没有相关仪器的情况下，也可以简单通过一个恒温水浴锅就可以完成，简单方便实用。

为了进一步验证本研究建立的方法的实用性，本研究用优化后建立的方法对保存的临床样品进行检测，同时采用比较成熟敏感的荧光定量PCR方法进行对比，结果发现，本研究获得的结果与荧光定量PCR方法获得的结果一致。为了进一步确定监测的准确性，阳性样品产物送测序公司进行序列测定，分析比对结果均为对应病毒序列，说明本研究建立的方法准确，适合于临床样品的检测。

本研究成功建立了一种PRRSV和PCV二重荧光LAMP检测方法，该方法检测特异性好，敏感性较高，方便快捷，在荧光下直接通过反应产物颜色判断结果，结果准确直观，可用于临床样品的检测，为临床快速检测区分PRRSV和PCV多提供了一种选择方法。