加米霉素的合成及其晶体结构测定

崔志刚,王建,甄盼盼,余贵菊,杨雪,王猛,姜淋洁,娄艳华,程雪娇

(天津市中升挑战生物科技有限公司, 天津 300380)

加米霉素[1](Gamithromycin) 化学名(IUPAC)：13-[(2,6-二脱氧-3-C-甲基-3-O-甲基-α-L-吡喃核糖基) 氧 ]-2-乙基-3,4,10-三脱氧3,5,8,10,12,14-六甲基-7-丙基-11-[[3,4,6-三脱氧-3-(二甲氨基)-β-D-吡喃木糖基]氧]-(2R,3S,4R,5S,8R,10R,11R,12S,13S,14R)-1-氧杂-7-氮杂环-15-单环。分子式：C40H76N2O12，CAS号：145435-72-9，是一种新型的第二代大环内酯类兽用抗生素。法国梅里亚公司(MERIAL.CO)生产的以加米霉素为主要有效成分的注射剂ZACTRAN，经欧盟药品监督管理局兽药署的审核，已经实现市场化生产和销售，加米霉素结构和功效已经得到了欧盟药监局兽药署的认可，可用于食用动物的食用，具有吸收快、体内分布广泛、体内残留低、安全性高等优点，暂无不良反应报道，是一种明确可以使用的兽用抗生素，在兽医临床具有广阔的应用前景，目前国内很多厂家已成功申报二类新兽药。对于作为药物或保健食品成分使用的化合物而言，晶体结构对化合物的稳定性，生物利用度等指标有重要影响。目前，研究晶体结构最常见和比较准确的方法是X-射线单晶衍射法。文献中已有报道该化合物的合成[2]，通常以9-脱氧-9-同型红霉素 A (E)肟为原料，经过构型转化反应，贝克曼重排反应，还原反应，还原胺化反应得到加米霉素，但是仍存在工艺不适合放大生产、不利于环保、生产成本高等问题。基于以上问题，对加米霉素的合成工艺进行优化改进，改变中间体的纯化方法，更换一些反应试剂，从而获得一种更适合放大生产的工艺，并且使整个反应过程更加安全环保，成本更加低廉。同时，首次获得加米霉素单晶，通过X - 射线衍射单晶结构测定其结构，并确定其构型。

1 材 料

1.1 仪器与试剂 XT-4A显微熔点仪，上海济成分析仪器有限公司；ARX 400 MHz核磁共振仪，瑞士Bruker公司；Bruker Smart Apex 单晶衍射仪，德国Bruker AXS 公司。

1.2 主要药品及试剂 氢氧化锂(纯度：98%)，无水乙醇(AR)，二氯甲烷(AR)，丙酮(AR)，对甲苯磺酰氯(AR)，碳酸氢钠(AR)，硼氢化钠(AR)，正丙醛(AR,97%)，钯碳(含钯5%)(纯度：95%)，甲醇(AR)，甲基叔丁醚(AR)，以上试剂均购于国药集团(天津)有限公司；9 - 脱氧 - 9 - 同型红霉素A(E)肟，批号：130603，纯度：95%，购于浙江国邦药业有限公司；TLC展开剂：二氯甲烷：无水甲醇：氨水 = 20∶1∶0.1。

2 方法与结果

2.1 加米霉素合成路线[3-4]

2.1.1 9-脱氧-9-同型红霉素A(Z)肟的制备[5-7]向500 mL三口瓶中加入9-脱氧-9-同型红霉素 A (E) 肟50.0 g、氢氧化锂4.8 g和无水乙醇500 mL，混合搅拌，室温反应4 h；向反应体系中滴加稀盐酸调节pH至8 ～ 9，然后加水100 mL，析出固体，过滤，烘干；所得固体用150 mL二氯甲烷打浆1 h,过滤，烘干得产品43.5 g，收率: 87%；熔点: 158～162 ℃；1HNMR(CDCl3):5.01(dd，H-13),4.87(d，H-1″),4.40(d，H-1′),3.98(m，H-5″),3.80(s，H-11),3.49(m，H-5),3.27(s，OCH3),3.21(dd，H-2′),2.99(t，H-4″),2.87(m， H-2,H-8,H-10),2.74(m，H-10),2.43(m，H-3′),2.32(d，H-2″),2.27(s，N(CH3)2),1.91(m，H-4),1.87(m，H-14),1.63(m，H-4′),1.37(m6-CH3),1.28(d，10-CH3),1.24(d，5″-CH3),1.18(d-5′-CH3),1.12(d，2-CH3),1.11(s，12-CH3),1.08(d，8-CH3),1.04(d，4-CH3),0.79(t，CH2CH3)。

2.1.2 9-去氧-12-脱氧-9，12-环氧-8a，9-二脱氢-8a-氮杂-8a-高红霉素A的制备 向500 mL三口瓶中加入9-脱氧-9-同型红霉素A(Z)肟40.0 g和200 mL丙酮,搅拌，溶解，降温至-5～5 ℃，滴加含对甲苯磺酰氯20.4 g的丙酮溶液100 mL，搅拌，反应0.5 h，然后滴加三乙胺10 mL，搅拌，反应1.5 h，TLC检测反应完成，过滤，滤饼用200 mL二氯甲烷溶解，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩得到产品37.2 g，收率95.4%，熔点:105～110 ℃；1HNMR(CDCl3):5.17(dd，H-13),4.73(d，H-1″),4.47(d，H-1′),4.15(dq，H-5″),4.09(dd，H-3),3.99(brs，H-5),3.81(t，H-11),3.68(m，H-8),3.65(m，H-5′),3.40(ddd，H-2′),3.23(s，OCH3),2.96(t，H-4″),2.70(m，H-2,H-8,H-10),2.70(OH-10),2.68(m，H-3′),2.57(brd，11-OH),2.45(p，H-2),2.31(s，N(CH3)2),2.28(d，H-2″),2.20(d，4″-OH),2.07(ddq，H-14a),1.90(brd，H-7a),1.75(dd，H-7b),1.74(m，H-4),1.70(m，H-4′),1.69(m，H-14b),1.46(dd，H-2′′),1.40(S，6-CH3),1.29(m，H-4′),1.27(d.10-CH3),1.27(d，5″-CH3),1.25(d，2-CH3),1.24(d，5′-CH3),1.21(S，3″-CH3),1.18(s，12-CH3),1.07(d，8-CH3),1.01(d，4-CH3),0.88(t，CH2CH3)。

图1 加米霉素合成路线

2.1.3 9-去氧-8a-氮杂-8a-高红霉素A的制备[8-9]

向500 mL三口瓶中加入9-去氧-12-脱氧-9,12-环氧-8a-氮杂-8a-高红霉素A 35.0 g，甲醇175 mL，搅拌溶解，降温-5～5 ℃，分批加入硼氢化钠9.0 g，加毕，搅拌反应2 h，滴加稀盐酸，调节pH至6～7，搅拌反应0.5 h，过滤，浓缩得到粗品9-去氧-8a-氮杂-8a-高红霉素A；将粗品加入到280 mL甲基叔丁醚中，滴加三氟乙酸6.6 g成盐，搅拌1 h，过滤，滤饼加入到200 mL的10%的碳酸钾溶液中，搅拌，加入175 mL二氯甲烷，萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到纯品32.9 g；收率：93.5%；熔点：176～180 ℃；1HNMR(CDCl3)5.00(d,H-1″),4.75(dd,H-13),4.48(br,d,H-3),4.34(d,H-1′),4.02(dq,H-5″),3.56(br,H-11),3.52(m,H-5),3.31(s,OCH3),3.16(dd,H-2′),3.01(brd,H-4″),2.78(m,H-8),2.69(dq,H-2),2.59(dd,H-9a),2.42(brt,H-9b),2.30(d,H-2″),2.26(s,N(CH3)2),1.91(m,H-14a),1.77(brp,H-4),1.61(brd,H-4′),1.55(dd,H-2′),1.44(m,H-14b),1.38(m,H-7),1.36(s.6-CH3),1.21(s,3″-CH3),1.20(d,5′-CH3),1.18(d,2-CH3),1.06(s,12-CH3),1.10(d,8-CH3),1.04(d,4-CH3),0.94(d,10-CH3),0.86(d,CH2CH3)。

2.1.4 加米霉素的合成[10]向500 mL高压釜中分别加入9-去氧-8a-氮杂-8a-高红霉素A25 g，正丙醛100 g，冰醋酸3.0 g，搅拌至溶解，加入钯/碳催化剂8.0 g，密封高压釜，釜内用氮气置换三次，氢气置换三次，充入氢气至压力1.4～1.6 MPa，35～45 ℃保温反应，观测压力不再下降。卸压，取样点板，检测原料反应完全，开启釜盖，加入纯化水200 mL，过滤，滤液加入150 mL二氯甲烷，降温至20 ℃以下，用20%盐酸调节pH≤4，萃取分液；水相再加入二氯甲烷150 mL，用20%氢氧化钠溶液调节pH≥10，萃取分液，无水硫酸钠干燥，浓缩，得到加米霉素成品20.0 g，收率：80%；1HNMR(CDCl3)：5.00(d,H-1″),4.75(dd,H-13),4.48(br,d,H-3),4.34(d,H-1’),4.02(dq,H-5″),3.56(br,H-11),3.5(m,H-5),3.31(s,OCH3),3.16(dd,H-2′),3.01(brd,H-4″),2.78(m,H-8),2.69(dq,H-2),2.59(dd,H-9a),2.42(brt,H-9b),2.30(d,H-2″),2.26(s,N(CH3)2),1.91(m,H-14a),1.77(brp,H-4),1.61(brd,H-4′),1.55(dd,H-2′),1.44(m,H-14b),1.38(m,H-7),1.36(s.6-CH3),1.21(s,3″-CH3),1.20(d,5′-CH3),1.18(d,2-CH3),1.06(s,12-CH3),1.10(d,8-CH3),1.04(d,4-CH3),0.94(d,10-CH3),0.86(d,CH2CH3)。

2.2 加米霉素的单晶培养及晶体结构测定[11]将1.0 g纯度99%的加米霉素白色固体加入到20 mL乙腈中，70 ℃加热溶解，冷却，静止放置，析出晶体。选取大小为0.22 mm×0.18 mm×0.18 mm的单晶，用Bruker Smart ApexII CCD衍生仪收集衍生数据。

2.2.1 晶体结构描述[12]晶体属于单斜晶系，C2空间群，具有手性，纯度大于99%，晶胞参数如表1和图2所示。

表1 加米霉素晶体结构数据

aR1= Σ || Fo|-| Fc||/| Fo|.bwR2= [ Σw(Fo2-Fc2)2/Σw(Fo2)2]1/2

图2 加米霉素的分子立体构型

3 讨 论

本研究以9-脱氧-9-同型红霉素 A (E) 肟为原料，通过构型转化反应，贝克曼重排反应，硼氢化钠还原反应和还原胺化反应得到加米霉素。其中，在构型转化这步反应中，由于在纯化过程中也有可能发生构型转化，因此，寻找一个合适的纯化试剂很重要。本文中采用二氯甲烷进行纯化，原因是原料9-脱氧-9-同型红霉素 A (E) 肟易溶于二氯甲烷， 而9-脱氧-9-同型红霉素 A (Z) 肟不溶于二氯甲烷，通过打浆搅拌的方法使成品纯度在97%以上，高于已报道文献[13]中纯度；该过程操作简单，容易得到纯品，适合大规模生产；文献[13]中，后处理方法采用先萃取再浓缩的方法得到产品，但是在后处理的过程中容易构型再次转变成原料，导致纯度不高。

在制备9-去氧-12-脱氧-9，12-环氧-8a，9-二脱氢-8a-氮杂-8a-高红霉素 A的过程中，如果9-脱氧-9-同型红霉素 A (Z) 肟纯度不高，反应中会产生很多杂质，该步骤也是难度比较大的一个步骤，本文使用三乙胺作为有机碱，不但减少杂质的数量，还减少了对身体的危害，保证了生产的安全性， 该步收率远高于文献[13]报道的收率，文献[13]中所用到的碱为有机碱吡啶及无机碱碳酸氢钠，有机碱吡啶有一定毒性，不适合放大生产，碳酸氢钠会产生一个比较大的杂质，9-羰基-8a-氮杂-8a-同型红霉素 A，很难除去。

在还原反应时，本文后处理未进行纯化操作直接进行还原胺化反应，减少操作步骤，降低产品损失，高于文献收率，工艺经优化后适合放大生产。对比文献[13]采用先还原再纯化的方法，然后再进行胺化反应，导致收率偏低。

加米霉素样品用乙腈作溶剂得到加米霉素单晶，确定了加米霉素晶体的空间点群和构效方式；加米霉素属于大环内酯类化合物，有多个手性中心，会形成很多不同构型，而通过加米霉素单晶解析最终确定了加米霉素的绝对构型，由于该晶体具有很好的晶型结构，对后续研究加米霉素新剂型，丰富临床给药方式，改善药代动力学，减少刺激性提高安全性等方面，具有一定的参考价值。