猪流行性腹泻病毒S蛋白不同表位基因的原核表达及免疫原性分析

朱利塞，贾爱卿，王贵平，李 菲，王 娟，邓胜朝，钱雪桥

（1.广东海大集团股份有限公司畜牧水产研究中心 海大中央研究院 农业农村部微生态资源养殖利用重点实验室，广州511400；2.广东海大畜牧兽医研究院，广州 511400）

猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的猪的一种高度接触性肠道传染病，感染的猪只主要表现为腹泻、呕吐和食欲下降等[1-2]。1970年，猪流行性腹泻最早在欧洲出现，随后相继在中国、加拿大、美国等国家暴发。1984年，王斌等[3-4]首次应用胎猪肠上皮细胞分离到猪流行性腹泻病毒，该病毒可感染各年龄段的猪，7日龄内的哺乳仔猪最为易感，死亡率高达80%～100%，给养猪业的健康发展带来严重威胁。

PEDV属于冠状病毒科冠状病毒属成员，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，病毒的基因组约为28 kb，5'端包含帽子结构，3'端包含一个多聚腺苷酸尾巴（PolyA）。病毒基因组包括7个ORFs，分别编码复制酶（1a、1b）、纤突蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），其中S蛋白是位于病毒表面的重要糖蛋白，能促进病毒与宿主细胞的融合，刺激宿主细胞产生中和抗体等作用[5-6]。S蛋白由S1（1～789 aa）和S2（790～1383 aa）两个亚基组成[7-9]，S1蛋白的COE区域（499～638 aa）是诱导机体产生中和抗体的主要抗原，同时，也有研究证明S2的N端具有中和表位[10-11]。S1蛋白的COE区和S2蛋白的N端在不同基因型的PEDV毒株间相对保守，是较好的PEDV疫苗候选抗原。本研究首先利用融合PCR的方法将S1蛋白的COE区与S2蛋白的N端连接，然后利用pET32a原核表达系统分别表达S1与S2的融合蛋白、S1蛋白的COE区及S2蛋白的N端，并对这3种蛋白质进行免疫原性分析，为PEDV亚单位疫苗的研制及抗体检测方法的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 病毒、细胞、血清CHYJ130330 PEDV分离株为实验室分离保存，猪抗PEDV的阳性血清为本实验室制备，Vero细胞为实验室保存。

1.2 主要试剂弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，pMD18-T载体、TaqDNA聚合酶、BamH I和SalI限制性内切酶购自大连宝生物有限公司；HRP标记的羊抗猪的IgG购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物的设计与合成根据本实验分离株CHYJ130330的基因组序列，设计3对表达引物（表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 PEDV S基因的引物Table 1 Primers used for amplification of the S gene

1.4 病毒RNA的提取及RT-PCR扩增将PEDV分离株CHYJ130330接种Vero细胞，待出现典型的CPE后，吸取病毒的上清液进行RNA的提取，RNA的提取方法按照Omega公司的RNA提取试剂盒进行。cDNA的合成按照（TOYOBO）的试剂盒进行，即10 μL的反应体系中加入2 μg的总RNA，特异性下游引物1 μL（20 μmol/L），反转录酶1 μL，0.5 μL RNA抑制剂（40 U/μL），ddH2O补加至10 μL，混合后42℃反应1 h，-20℃保存备用。PCR的扩增以高保真的DNA聚合酶进行，扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸100 s，共30个循环；最后72℃终延伸10 min。PCR扩增的条带用1%的琼脂糖凝胶进行鉴定。

1.5 质粒的构建将PCR扩增正确的目的条带分别利用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行纯化，纯化后的目的基因分别克隆至pMD18-T载体上，通过PCR和测序方法对重组质粒进行鉴定，将测序正确的重组质粒双酶切后克隆至pET32a原核表达载体上，通过PCR和酶切验证筛选出阳性质粒，分别命名为pET32a-S1、pET32a-S2及pET32a-2S，并送测序进行验证。

1.6 蛋白的表达与Western blot分析将测序正确的pET32a-S1、pET32a-S2及pET32a-2S分别转化到BL21（DE3）细胞中，挑取单克隆于37℃摇床培养，当D600值为0.4～0.6时，加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导表达，并通过SDS-PAGE对表达的重组蛋白进行鉴定，纯化重组蛋白。应用Western blot对表达的重组蛋白进行鉴定，以猪抗PEDV的阳性血清为一抗，二抗为HRP标记的羊抗猪的IgG。

1.7 重组蛋白的免疫原性鉴定将纯化后的重组蛋白分别与弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂按1∶1混合乳化，按照免疫程序免疫小鼠，每只小鼠的免疫剂量为50 μg，每次的免疫时间间隔为14 d，经3次免疫后分别收集血清。通过包被PEDV全病毒及优化ELISA的条件建立检测PEDV抗体的方法，并应用该方法分别对3种蛋白免疫前和3免后的血清效价进行测定，比较分析3种蛋白所产生的抗体效价的高低。

2 结果

2.1 S1、S2及2S基因的扩增以CHYJ130330毒株的cDNA为模板，分别扩增S1的COE区、S2的N端及S1和S2的串联基因，扩增的条带经琼脂糖凝胶鉴定，结果见图1，目的条带大小与预期相符，分别为729 bp、525 bp和1254 bp。

2.2 质粒的构建将S1、S2及2S基因纯化后克隆至pMD18-T载体上，用BamH I/SalI进行双酶切验证，目的条带大小与预期相符，结果见图2。将测序正确的阳性质粒pMD18-T-S1、pMD18-T-S2及pMD18-T-2S分别用BamH I/SalI双酶切后，将目的基因克隆至pET32a原核表达载体上，重组质粒分别命名为pET32a-S1、pET32a-S2及pET32a-2S，双酶切鉴定结果见图3。

图1 S1、S2及2S基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of S1, S2 and 2S gene

2.3 蛋白的诱导表达与鉴定将上述原核表达质粒分别转化到BL21（DE3）细胞中，加入IPTG，16℃条件下诱导20 h后收集菌体，与未诱导组相比，诱导组的细菌均表达出与预期大小相符的重组蛋白，S1、S2及2S蛋白大小分别为26 kDa、20 kDa及46 kDa，由于pET32a载体的标签蛋白的大小为19 kDa，所以融合蛋白的大小分别为45 kDa、40 kDa及65 kDa，结果见图4。对表达的蛋白进行Western blot鉴定，发现这3个蛋白均与阳性的猪抗PEDV的抗血清发生反应（图5），表明重组蛋白表达正确。

2.4 重组蛋白的纯化表达结果显示，3个重组蛋白均为非可溶性蛋白，同时将3个重组蛋白分别使用Ni柱进行纯化，纯化后的目的蛋白条带单一，纯化效果较好，结果见图6。

2.5 S1、S2及2S重组蛋白免疫原性鉴定应用实验室已建立的ELISA方法，分别对S1、S2及2S重组蛋白3免后采集的小鼠血清和阴性血清效价进行测定，3种血清的效价分别为1∶3200、1∶3200及1∶4800，说明3种重组蛋白均具有一定的免疫原性，且串联表达的重组蛋白2S产生的抗体效价最高，说明其免疫原性强于重组蛋白S1和S2。

图2 重组质粒pMD18-T-S1、pMD18-T-S2 及pMD18-T-2S的双酶切鉴定Fig.2 Identification of pMD18-T-S1, pMD18-T-S2 and pMD18-T-2S plasmid by double digestion

图3 原核表达质粒的双酶切鉴定Fig.3 Identification of prokaryotic expression plasmid by double digestion

3 讨论

近年来，PEDV在我国不断暴发，给养猪业带来了严重的经济损失，疫苗免疫和及时诊断是预防和控制该病的有效措施。S蛋白是位于病毒表面的纤突蛋白，不但能介导病毒入侵宿主细胞，而且能刺激宿主细胞产生中和抗体[12-13]。因此，无论是PEDV亚单位疫苗的研究还是PEDV检测方法的建立，大多数首选S蛋白作为靶蛋白。有研究证实，串联的抗原表位可以增强抗原的免疫原性，所以本研究选择S1的COE区、S2的N端为研究对象，将S1的COE区和S2的N端串联共表达，比较分析3个蛋白的免疫原性。

pET表达系统具有蛋白表达量高、稳定性较好、蛋白易于纯化等优点，所以本研究选择pET32a原核表达载体进行目的蛋白的融合表达，在诱导时摸索重组蛋白的诱导温度、诱导时间、诱导剂的浓度等条件，最后确定这3个目的蛋白在诱导温度为20℃，诱导时间为24 h，IPTG浓度为1.0 mmol/L时表达量较高。通过Western blot 分析显示，3个蛋白均能与PEDV阳性血清发生特异性的抗原抗体反应，而不与pET32a空载体发生反应，将3个蛋白纯化后分别免疫小鼠制备多克隆抗体，3免后免疫重组蛋白2S小鼠的血清效价高于免疫重组蛋白S1和S2小鼠的血清效价，充分说明了2S重组蛋白具有良好的免疫原性，为后续的基因工程亚单位疫苗研制提供了有力参考。且与传统疫苗相比，基因工程疫苗具有安全、价廉、多价、易于储存运输、具有较好的靶攻击性等优点，是疫苗发展的理想方向。

图4 重组蛋白的诱导表达结果Fig.4 Results of expression of recombinant proteins

图5 重组蛋白的Western blot鉴定Fig.5 Western blot identification of recombinant protein

图6 重组蛋白的纯化Fig.6 Purification of recombinant protein