焉耆马ACTN3 基因多态性及其与耐力赛速度的关联性分析

王建文 ，姚新奎，任万路，王川坤，褚洪忠，罗鹏辉，闫 睛，孟 军*

（1.新疆农业大学动物科学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆马繁育与运动生理重点实验室，新疆乌鲁木齐 830052；3.新疆伊犁哈萨克自治州畜牧科学研究所,新疆伊犁 835000；4.新疆维吾尔自治区畜牧总站，新疆乌鲁木齐 830009）

ACTN3基因是第一个被证实的与运动能力相关的重要候选功能基因之一。Myosotis 等[1]通过对意大利优秀短跑运动员（100～400 m）的研究发现，ACTN3基因R577X 突变位点未检测到XX 基因型，表明该突变位点对于速度性能的发挥可能不利，而更适宜于耐力性运动[2]；相关研究显示，ACTN3基因R577X 突变位点XX 基因型的个体达到呼吸阈及呼吸补偿点的速度更快，维持较高速度的运动所需运动强度也较低[3]，其有氧运动能力也更强[4]。

对马的研究发现，ACTN3基因多态性可能与其运动性能相关[5]。国外已对纯血马[6]、法国骑乘马[7]、夏尔马[8]、克莱兹代尔马[8]和阿拉伯马[9]、巴西运动马[10]等的ACTN3基因多态性进行了相关研究，均未检测到与人类似的无义突变。但对澳大利亚5 个品种马进行检测发现，位于第1 外显子前端启动子区域的突变位点（A1104G）及位于第15 外显子附近的5 个内含子突变（G9764A、G9773A、G9783A、G9789A 和A9803G）在不同品种马间存在着显著差异[8]，且各品种马用途不同，其中纯血马为优秀的速度型品种，而夏尔马、克莱兹代尔马则是重挽型品种，这暗示着该基因可能与马匹的运动性能有关[8]。对阿拉伯马及巴西运动马的研究也显示ACTN3基因突变对马匹调教训练会产生影响[9-10]。国内对蒙古马[11]、伊犁马[12]的研究也显示ACTN3基因可能会对马匹的运动性能产生影响。

焉耆马为我国优良的地方马品种[13]，具有较好的挽力、速力及持久力[14]，适宜于耐力赛[15-16]。本研究检测了35 匹参加巴音布鲁克耐力赛的焉耆马ACTN3基因多态性，通过耐力赛测试马匹各赛段及全程速度，并分析ACTN3基因突变位点基因型与耐力赛速度之间的关系，以期筛选适宜于焉耆马耐力性能的分子辅助标记，为耐力赛焉耆马的选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 选取参加新疆巴音布鲁克马术耐力赛参赛焉耆马35 匹为研究对象，实验马匹无亲缘关系。所有参赛马匹通过柠檬酸钠抗凝管采集左侧颈静脉血液样本5 mL，轻微震荡后通过冰盒带至实验室，置于-20℃保存备用。

1.2 耐力性能测定 通过耐力赛测定参赛马匹的耐力性能。耐力赛总距离为81 km，为保障马匹福利，根据国际马联（FEI）关于耐力赛马的相关规定，将总距离分为3 个赛段，其中第1 赛段距离为39 km，第2 赛段距离为21 km，第3 赛段距离为21 km，每2 个赛段之间设置休息点，参赛马匹在休息点进行休息，测试马匹心率须在20 min 内恢复至64 bmp，之后方可进行下一赛段，每个赛段记录参赛马匹成绩。本次耐力赛共有29匹马完赛，6 匹因心率未在规定时间内恢复至指定范围而中途退赛。

1.3 引物设计 根据NCBI 公布的纯血马ACTN3基因序列（序列号： HQ005425），采用Primer-BLAST 对第1、15、20 和21 外显子进行引物设计，由于第20 外显子和第21 外显子之间距离较小（小于350 bp），因此采用一对引物进行扩增，共设计3 对引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.4 PCR扩增 PCR体系25 μL：上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，dNTP（10 mmol/L）0.5 μL，Taq Buffer 2.5 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL，ddH2O 加至总体积25 μL。采用降落PCR 法进行扩增，扩增程序为：95℃预变性3 min，94℃变性30 s，63℃退火45 s，共计10 个循环，每个循环降低0.5℃，72℃延伸1 min，94℃变性30 s，58℃退火45 s，72℃延伸1 min，30 个循环，72℃修复延伸10 min。

1.5 基因分型 将所有PCR 扩增产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行基因测序，将测序结果通过DNAStar 软件进行校正，并与公布的纯血马ACTN3基因序列进行比对，通过BLAST 分析并确定突变位点及基因型。

1.6 统计分析 通过Excel 表格进行数据整理，计算各突变位点的基因型频率、等位基因频率、群体杂合度、有效等位基因数、多态信息含量，并进行Hardy-Weinberg 平衡状态检验。通过HaploView 4.2 软件进行单倍型构建与分析。通过SPSS18.0 软件对完赛与未完赛马匹基因型、等位基因频率进行卡方检验，通过One-Way ANOVA 法对不同基因型及单倍型组合马匹各赛段速度、全程速度进行方差分析，采用Duncan's 方法进行多重比较，结果以平均数±标准差表示。P＜0.05表示差异显著，P＞0.05 表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1ACTN3基因测序与分型 通过对3 对引物所扩增的产物进行测序并比对，共计检测出8 个突变位点（图1），其中第1 个位于启动子区域：A1104G，共检测出3 种基因型（AA、AG 和GG 基因型）；5 个位于内含子区域：G9764A（GG 和AA 基因型）、G9773A（GG、GA 和AA 基因型）、G9783A（GG、GA 和AA 基因型）、G9789A（GG、GA 和AA 基因型）和A9803G（AA、AG 和GG 基因型）；2 个位于外显子区域：C11304T（CC、CT 和TT 基因型）和A11517G（AA、AG 和GG 基因型），且均为同义突变。

2.2 群体遗传学分析 由表2 可知，在本研究的焉耆马中，A1104G、A9803G 和A11517G 位点的优势等位基因为A，G9764A、G9773A、G9783A 和G9789A 位点的优势等位基因为G，C11304T 位点的优势等位基因为T。χ2检验结果表明，A1104G、G9789A 和A11517G突变位点处于Hardy-Weinberg 平衡状态，其余位点处于不平衡状态。由表3 可知，G9773A 突变位点在本研究中为低度多态（多态信息含量＜0.25），其余突变位点均为中度多态（0.25＜多态信息含量＜0.50）。通过HaploView 4.2 软件对检测出的2 个外显子突变（C11304T 和A11517G）进行单倍型构建，共有4 种单倍型，TA、CC、CA、TG 的频率分别为0.273、0.245、0.241、0.241，TA 为优势单倍型。

表2 焉耆马ACTN3 基因多态位点的基因型及等位基因频率

表3 焉耆马ACTN3 基因多态位点的遗传多态性

2.3ACTN3基因多态性与耐力赛速度关联性分析 通过对完赛与未完赛焉耆马ACTN3基因突变位点基因型及等位基因频率进行卡方检验，结果如表4 所示，在G9764A、G9789A 和C11304T 突变位点基因型频率呈显著差异，等位基因频率呈极显著差异，其中在未完赛马匹中G9764A 突变位点不含AA 基因型，G9789A 突变位点不含GG 基因型，C11304T 突变位点不含CC 基因型；在A11517G 突变位点等位基因和基因型频率均呈极显著差异，且该位点未完赛马匹不含AA 基因型。

表4 完赛与未完赛马匹基因型频率及等位基因频率卡方检验

由表5 可知，G9773A 突变位点AA 基因型在第3赛段速度显著快于AG 基因型，但与GG 基因型差异不显著，且第1 赛段、第2 赛段及全程速度3 种基因型之间差异不显著。G9789A 突变位点AA 基因型第1 赛段速度显著快于AG 基因型，在第3 赛段GG 基因型速度显著快于AG 基因型，但在3 个赛段及全程速度方面AA 基因型与GG 基因型之间差异均不显著。A9803G突变位点AG 基因型第2 赛段和全程速度快于AA 基因型，AA 基因型与GG 基因型在3 个赛段及全程速度方面无显著差异。C11304T 突变位点CC 基因型第1 赛段速度极显著快于TT 基因型，显著快于CT 基因型；CC基因型第2 赛段速度极显著快于CT 基因型和TT 基因型；全程速度方面CC 基因型显著快于CT 基因型和TT基因型。A11517G 突变位点AA 基因型第1 赛段速度极显著快于GG 基因型，AG 基因型显著快于GG 基因型；AA 基因型第2 赛段速度极显著快于AG 基因型和GG 基因型，AG 基因型速度显著快于GG 基因型；AA基因型和AG 基因型第3 赛段速度均显著快于GG 基因型；全程速度方面AA 基因型极显著快于GG 基因型，AG 基因型显著快于GG 基因型。

以2 个外显子突变位点（C11304T 和A11517G）构建的单倍型对完赛马匹进行分组，对不同单倍型组合焉耆马完赛马匹耐力赛速度进行差异性分析，其中TA/TA 单倍型组合个体在完赛马匹中仅检测出1 匹，故未放入此分析中，结果如表6 所示，在所有单倍型组合中，CG/CA 和CA/CA 速度最快，且CG/CA 和CA/CA 单倍型组合马匹第1 赛段、第2 赛段速度及全程速度均极显著快于TG/TG 单倍型组合，CG/CA 单倍型组合第3赛段速度显著快于TG/TG 单倍型组合。

3 讨 论

ACTN3基因仅在快肌纤维及心肌中表达[12]，对人的研究结果显示，该基因的R577X 位点能发生无义突变[17-18]，使得编码577 号氨基酸（精氨酸）的密码子突变为终止密码，其中具有纯合子XX 基因型的个体将完全不产生ACTN3 蛋白质。对该基因与人运动性能的关联性研究结果显示R577X 位点X 等位基因对于耐力性能有利[19-21]，ACTN3基因R577X 位点的纯合子XX 基因型将导致快肌纤维中缺乏ACTN3 蛋白，使得个体快速伸缩能力降低，耐力性能提升[22]。对小鼠的研究显示，当ACTN3基因敲除后其ACTN2基因的表达上调[23]，但小鼠表现出较野生型小鼠抓地力下降的现象，其耐力性能测试显示基因敲除小鼠在竭力运动中所跑动距离更长[24]；小鼠的运动训练实验结果显示，野生型小鼠力竭运动距离为未经训练野生型小鼠的2 倍，而基因敲除小鼠训练后的力竭运动距离为未经训练基因敲除小鼠的3.3 倍[25]。

表5 焉耆马ACTN3 基因多态位点不同基因型与耐力赛速度的关联分析 km/h

表6 焉耆马ACTN3 基因不同单倍型组合与耐力赛速度的关联分析 km/h

对纯血马[6]、法国骑乘马[7]和夏尔马[8]的研究结果显示，在第1 外显子前端的启动子区域有1 个突变位点（A1104G），在第15 外显子附近有5 个内含子突变，在第20 和第21 外显子分别具有1 个同义突变。本研究在焉耆马中共检测出8 个突变位点，各突变位点与前人研究结果一致[8]。χ2检验结果表明A1104G、G9789A和A11517G 突变位点处于Hardy-Weinberg 平衡状态，而其余突变位点则处于Hardy-Weinberg 不平衡状态，这主要是因为在本次实验采样过程中，所采集血样的焉耆马均为参加比赛马匹，这些马匹在参赛之前的挑选均有着较大的人为干预因素，由此造成马匹采样出现了非随机性，从而使得本次实验中出现了较多位点处于不平衡状态[26-27]；同时也可能是由于本实验所采集马匹的样本量较小或由于所检测突变位点大部分为中度多态位点，这些都可能造成平衡状态被打破[28]。本研究显示，除G9773A 突变位点外，其余各突变位点均处于中度多态位点，表明这些中度多态位点具有较高的选择潜力[29]，可以在今后的育种过程中加以利用。

本研究中，对完赛与未完赛焉耆马的基因型频率及等位基因频率进行卡方检验结果显示，G9764A、G9789A、C11304T 和A11517G 突变位点的基因型频率及等位基因频率在2 组马匹之间呈现显著差异性，这暗示着这些突变位点可能会通过影响马匹力竭运动距离来影响马匹的耐力性能。

对各突变位点与焉耆马耐力赛速度进行关联性分析结果显示，在所检测到的外显子突变中，C11304T 和A11517G 突变位点均会影响到焉耆马的耐力速度性能，其中在C11304T 突变位点表现出CC 基因型第1 赛段、第2 赛段及全程速度均显著或极显著高于TT 基因型，这表明该突变位点CC 基因型更适宜于焉耆马耐力赛；A11517G 突变位点则表现出AA 基因型在所测各阶段速度均显著或极显著高于GG 基因型，这表明A11517G 突变位点的AA 基因型更适宜于焉耆马耐力赛；单倍型分析结果显示这2 个突变位点的优选组合为CG/CA 和CA/CA 基因型。虽然这2 个突变位点均为同义突变，并不会造成在基因表达过程中的氨基酸改变，但这些突变位点可能会与其他突变位点共同作用，从而对运动产生影响；也可能与其他上下游相关基因或者与ACTN3基因关联作用的基因（如ACTN2等）进行连锁，从而通过信号传导等机制对马匹的运动性能产生影响[30]。根据对人及基因敲除小鼠的研究，当该基因不表达时会对运动产生影响，对马的研究结果也显示调教训练会使得该基因的表达发生改变[9]，提示该基因的表达可能会影响到马匹的运动性能。相关研究结果也显示，人工选择等因素影响会造成部分物种对密码子的使用产生一定的偏好性，而这种偏好性将会影响到基因的表达[31]，同时同义突变也会对蛋白质的翻译效率产生影响[32]；这也可能是这2 个突变位点影响到焉耆马耐力性能的原因，但具体影响机制还有待更加深入的研究。由于耐力赛参赛马匹相对较少，该研究结果（显著性SNP 及单倍型）尚有待于大样本量实验进行进一步验证。

4 结 论

本研究结果表明，焉耆马ACTN3基因与耐力赛速度相关，其中C11304T 和A11517G 突变位点对其全程速度有着显著影响，主要表现为CC 基因型和AA 基因型显著或极显著高于其余2 种基因型，单倍型组合中CG/CA 和CA/CA 基因型为优选基因型组合，因此可将C11304T 和A11517G 突变位点作为焉耆马耐力赛速度性能的候选分子辅助标记之一。

致谢：本研究在采样过程中得到了巴音布鲁克马术耐力赛组委会的大力支持，谨此致谢！