人羊膜间充质细胞诱导成骨及与胶原-明胶海绵载体复合的实验研究

王芳 宋庆高 郭佳男 陈尚 何苇 邹亚莉

(遵义医科大学附属口腔医院口腔颌面外科，贵州 遵义 563000)

牙槽突裂常与唇腭裂并发，是最常见的先天颅面部发育畸形之一，但目前的治疗手段效果不尽人意。近年来，随着组织工程及干细胞技术的兴起，学界普遍认为这将有望是修复牙槽突裂的新方法。而有研究发现，羊膜来源的干细胞免疫原性低，具有免疫调节和免疫抑制作用等优点，同时来源丰富、扩增能力强、易于富集，且无医学伦理学的争议[2-3]，具有作为修复人体组织的种子细胞的特性和潜力。由于先天性牙槽突裂往往在出生时才被发现，若此时患者自身的羊膜在其后期的修复上可以得到充分的利用，相较于其他来源的干细胞就可以不用考虑免疫排斥反应的问题。因此，本研究以人羊膜间充质细胞(human amniotic mesenchymal cells，hAMCs)及经成骨诱导的hAMCs作为种子细胞，并将其负载于胶原-明胶海绵上进行复合培养，为将来动物实验及临床应用修复牙槽突裂缺损提供前期体外实验基础。报告如下。

1 材料与方法

1.1一般资料 (1)组织标本的采集和实验分组:经遵义医科大学附属医院伦理委员会批准以及产妇知情同意后，从遵义医科大学附属医院手术室无菌采集8例足月剖宫产胎盘，hAMCs的分离培养在采集后2 h内进行。培养至第三代后随机分为正常培养基培养的正常对照组和成骨诱导培养基培养的成骨诱导分化组。(2)实验试剂为：胶原酶Ⅱ(美国Sigma公司)，胰蛋白酶(美国Amreseo公司)，DNaseⅠ(美国Worthington公司)，FBS(美国Gibco公司)，L-glutamine(美国Hyclone公司)，L-DMEM(美国Gibco公司)，人单抗CD29-PE、CD44-PE、CD73-FITC、CD166-FITC、CD34-PE(美国BD公司)，β-甘油磷酸钠(美国Sigma公司)，地塞米松(瑞士Alexis公司)，维生素C(美国Sigma公司)，明胶海绵(中国南京金陵制药厂)。(3)实验仪器为：倒置相差显微镜(CX40RF400，日本Olympus公司)，自动显微照相装置(PM20-35，日本Olympus公司)，二氧化碳培养箱(3141，美国Forma公司)，流式细胞仪(FACS calibur，美国Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1实验试剂的配置 L-DMEM培养基:低糖型DMEM培养基干粉1包及NaHCO33.7g，将其溶于1 000 mL超纯水中，混匀并调pH值至7.25，过滤除菌，分装，4℃保存；10% EDTA-2Na:EDTA 100 g及NaOH 15g，将其溶于450 mL蒸馏水(60-70℃)，搅拌直至完全溶解，加入0.2M的PBS 500 mL，调节pH值至7.3，蒸馏水定容为1 000 mL，常温保存；培养基I:L-DMEM 87 mL，10% FBS(1 mol)，2 mLL-谷氨酰胺，100 u/mL青霉素，0.1mg/mL链霉素；成骨诱导培养基:培养基I中加入100 nmol/L地塞米松、50 ug/mL维生素C和10 nmol/L β-甘油磷酸钠。

1.2.2hAMCs的分离、培养和鉴定 用机械法及酶分离法得到原代hAMCs，培养于培养基I中，培养至第三代用波形蛋白标记后进行免疫组织化学染色，另外同时用多色荧光标记后(荧光标记人单抗CD73-PE、CD44-PE、CD45-PerCP、CD34-PE、CD29-PE-Cy5、CD49d -FITC、CD166-PE)，流式细胞术对其进行分选鉴定，利用Cell Quest软件进行表型分析。

1.2.3hAMCs的成骨诱导及鉴定 将第三代hAMCs以5×105个/mL密度接种于培养瓶内，待其生长密度达到80-90%的面积后，弃去培养基，换成成骨诱导培养基。于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养生长，每隔3 d更换培养基，于倒置相差显微镜下观察细胞形态变化。诱导21 d后，利用茜素红进行染色检测钙盐沉积，显微镜下观察并照相。培养瓶中细胞用于后续胶原-明胶海绵载体复合培养实验。

1.2.4hAMCs与胶原-明胶海绵载体的复合 将胶明胶海绵于超净台切成0.3 cm×0.5 cm大小，置于平皿内，用鼠尾胶原浸满24 h，自然晾干后取出，PBS缓冲液冲洗3次后，再用L-DMEM培养基清洗至培养基不变色。将第3代hAMCs以及经诱导21 d后的hAMCs消化，制成6×106个/mL的细胞悬液，吸取100μl细胞悬液，分别接种于胶原-明胶海绵载体，复合培养72 h后观察。

1.3统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计学数据分析，各组间的数值以单因素方差分析(One-way ANOVE)，以P<0.05表示结果差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1hAMCs的表型分析 倒置相差显微镜观察显示:第三代hAMCs在培养24 h后，大部分贴壁细胞变为梭形或多角形，接种3-4 d覆盖面积可达90%以上，细胞呈漩涡状排列生长。流式细胞术分选结果显示:第三代hAMCs高表达CD29、CD166 、CD44、CD73、CD49d等间充质干细胞表面标志，但不表达CD34、CD45等造血细胞和MHC-II类分子表面标志(图1)。免疫组织化学结果显示:第三代hAMCs波形蛋白染色阳性(图2)。

2.2hAMCs的成骨分化及鉴定 hAMCs经成骨诱导后细胞形态由长梭性(图3A)逐渐变成多角形(图3B)，诱导21 d后被茜素红染色检测发现呈红染的钙结节(图3C)。

2.3hAMCs与胶原-明胶海绵复合体 倒置相差显微镜观察显示:第三代hAMCs与胶原-明胶海绵载体复合培养后的24 h内，细胞贴壁能力较弱，晃动可导致细胞脱离。复合培养72 h后，hAMCs在胶原-明胶海绵上生长牢靠，且在外力作用下不易脱落，细胞数量显著增多，细胞生长状况良好(图4)，胶原-明胶海绵在1周后出现液化降解。

注：A.未作处理的胶原-明胶海绵(×100)；B.hAMCs与胶原-明胶海绵复合培养后即刻(×100)；C.hAMCs与胶原-明胶海绵复合培养后72 h(×100)图4 hAMCs与胶原-明胶海绵复合培养(箭头所指为细胞聚集区)

3 讨 论

先天性唇腭裂是人类新生儿最常见的出生缺陷之一，且往往合并有牙槽突裂的发生，而对于牙槽突裂的修复重建目前仍以自体髂骨骨松质移植的方法为主，为了避免髂骨量限制及开辟第二术区给患者带来的痛苦，随着对组织工程及干细胞的研究越来越深入，近年来越来越多学者的研究主张使用组织工程及干细胞技术骨修复牙槽突裂，遗憾的是仍未寻找到一种理想的种子细胞。自从In't Anker等首先从人羊膜中分离出大量的间充质细胞并发现在特定的环境下可以将其向成骨样细胞和脂肪样细胞分化以来，hAMCs逐渐为越来越多研究者们所关注。hAMCs来源于孕妇生产胎儿的遗弃物——胎盘，来源广泛充足且没有医学伦理学的争议，有研究报道从一份人羊膜所分离的hAMCs的细胞数量可高达(6.72±1.21)×107个，因此数量上也不存在问题，另有研究表明hAMCs表达间充质干细胞的表面标志物，如CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、波形蛋白等，不表达CD34、CD45等造血细胞的表面标志。我们的实验研究结果显示:本课题组培养的hAMCs中CD73、CD29、CD44、CD166、CD49d高表达，CD34、CD45不表达，因此为高纯度的hAMCs，符合后续实验的需求。而且加入一定的成骨诱导剂可使其向成骨细胞分化，使得hAMCs具有成为利用组织工程手段修复牙槽突裂的种子细胞的潜能。

组织工程技术能否成功与理想的细胞载体密切相关。于开涛等的研究发现，经胶原处理后的明胶海绵更有利于成骨细胞的增殖和分化，同时也证明了明胶海绵是良好的基质材料和组织工程骨良好的载体。王海燕等在经多聚赖氨酸处理过的明胶海绵上接种骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，72 h后发现细胞粘附在明胶海绵的深面。1周后明胶海绵开始降解，并成功的向神经元样细胞分化，研究证实经多聚赖氨酸处理过的明胶海绵与BMSCs具有良好的相容性。结合牙槽突裂修复的特点，其支架材料的选择更应着重注意良好的可塑性、可降解性及可吸收性，因此，我们采用的是容易获得，价格低廉，生物相容性好，可吸收，X线可透射，利于成骨细胞增殖分化等特点的明胶海绵。为了使细胞更容易的生长于支架上，对明胶海绵采用胶原预处理。在实验中观察到hAMCs种植于胶原-明胶海绵载体上复合培养24 h后，倒置相差显微镜观察见细胞成群生长，48 h后胶原-明胶海绵表面细胞数量明显增多并连成片状，72 h后细胞进一步增多且晃动时不易脱落。这些发现都与之前文献的报道基本一致，也表明了hAMCs与胶原-明胶海绵具有较好的生物相容性。同时，相较于未经成骨诱导的hAMCs，我们观察到经诱导后的hAMCs的增殖速度有所下降，此外在胶原-明胶海绵上的生长状况也较差，这可能与hAMCs诱导后其表面标志改变及干细胞特性减弱有关。

综上，我们的研究结果表明hAMCs具有成骨分化的能力，而且与胶原-明胶海绵载体复合培养后生长良好，显示了hAMCs具有成为组织工程修复牙槽突裂的种子细胞的潜能，为后续进行动物体内实验提供了前期体外实验基础。

(本文图1～3见封三)

图1 ｈＡＭＣｓ表型的流式细胞术分选结果

注：Ａ．波形蛋白染色阳性（如箭头所示）（×４００）；Ｂ．阴性对照（×４００）图2 ｈＡＭＣｓ免疫组织化学染色

注：Ａ．诱导前（×１００）；Ｂ．诱导中（×１００）；Ｃ．诱导２１ｄ后发现红染的钙结节（如箭头所示）（×１００）图3 ｈＡＭＣｓ成骨诱导２１ｄ后茜素红染色结果