颗粒细胞Cx37的表达与预测卵泡成熟率及IVF-ET妊娠结局的相关性研究

须文驰 陈卓 黄官友 赵淑云△

(1.贵州省人民医院生殖医学科,贵州 贵阳 550003;2.贵州医科大学附属医院生殖中心,贵州 贵阳 550002)

当前，全球不孕不育患者已占育龄夫妇的10%[1]，在我国调查显示该比例高达15%[2]，不孕不育已成为全球性复杂社会学问题的疾病亟待解决。体外受精-胚胎移植(IVF-ET)是治疗不孕症最有效的措施之一，为无数不孕不育患者拥有健康后代带来了希望[3]。卵泡作为女性生殖的基本单位，其发育是一个复杂的过程。在显微镜下卵泡结构为卵母细胞周围包绕透明带，其获取信号的唯一途径是通过透明带与其包绕的颗粒细胞形成胞间通讯。细胞之间的通讯有多种方式，其中以细胞间的间隙连接方式进行的细胞间直接的信息交流成为主要细胞间间隙连接通讯。连接蛋白家族的蛋白形成细胞间间隙连接的通道。小鼠中至少发现17种连接蛋白(Connexin，Cx)，这些蛋白的胞内环及C末端的氨基酸序列及长度各异，保证了蛋白功能的多样性。颗粒细胞可产生多种营养因子，以支持卵泡的生长和成熟，而卵母细胞也可分泌多种作用于颗粒细胞表面的细胞因子对应的受体，其中这些物质转运及信息传递在间隙连接的存在下得以进行[4]。颗粒细胞是卵泡液中最大的细胞群，作为已知存在于卵泡液中的间隙连接蛋白，目前甚少研究Cx37与卵泡成熟的关系，这种细胞间间隙连接蛋白的表达及适时关闭通道，是否会促进卵泡的成熟并获得优质的卵泡提高辅助生殖技术的成功率，目前尚不清楚。本研究旨在于通过测定卵泡液中颗粒细胞表面Cx37的表达，以评价其对卵泡成熟的质量影响并探讨其预测妊娠结局的价值，为进一步提高辅助生殖成功率及活产率提供可能。报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2017年5月至2018年2月在贵州医科大学生殖中心首次因单纯输卵管因素进行常规IVF-ET治疗的患者为研究对象，本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书，并在我院备案。纳入标准：年龄≤35岁；月经规律；既往无自然流产史。排除标准：近3个月曾服用甾体类激素类药物治疗；患有子宫内膜病变、内分泌疾病、排卵障碍等疾病；诊断不明原因不孕、免疫性不孕、子宫内 膜异位症、盆腔结核史等疾病；男性不育。

1.2方法

1.2.1卵巢刺激方案、捡卵 所有患者均采用标准长方案及拮抗剂方案控制性超促排卵。捡卵操作参考本中心操作常规指南，取剩余卵泡液。

1.2.2颗粒细胞采集、孵育 15 mL每离心管中加入6 mL人外周血淋巴细胞分离液；2 000 r/min离心5 min，留取沉淀及上清液吸管吹打，用吸管小心加于分离液之液面上后2 500 r/min离心25 min；用吸管小心吸取第2层环状乳白色细胞层至另1离心管中，向所得离心管中加入10 mL生理盐水，混匀细胞，2 000 r/min离心5 min，弃上清，重复3次。-80度低温保存。细胞计数：收集标本用PBS重悬，用0.04%台盼蓝染色3 min，细胞计数板计数。共取3个标本检测，细胞数均约为1～1.5×107个/mL。一抗孵育：在含有10%FCS、1%叠氮化钠的冰冷PBS溶液中重悬细胞至约1～5×106个/mL；取

两根离心管，分别标记为A、B两管，向每管中加入100 uL单细胞悬液；A管中加入1μL Cx37兔多克隆一抗，B管中加入1 μL兔IgG同型对照单克隆抗体作为对照组；室温下避光孵育30 min；以400 g的速度离心5 min，在4度保存PBS中重悬，共3次。二抗孵育：于A、B两管中均加入1.5μL FITC标记小鼠抗兔二抗，重悬；黑暗环境下室温孵育30 min；以400 g的速度离心5 min，PBS溶液中重悬，共3次。

1.2.3流式细胞术测定颗粒细胞上间隙连接蛋白37表达水平 根据标本量体积，设定流式细胞仪自动计数5 000～10 000个。使用同型对照管的细胞调节FSC和SSC荧光通道的光电倍增管的电压，将自发荧光控制在数轴的1/4范围内，并根据各标本具体情况适当调整电压。

2 结 果

2.1Cx37的表达与MⅡ卵率的相关性研究 Cx37的表达与MⅡ卵率呈显著负相关(r=-0.445，P<0.05)。

2.2两组患者Cx37表达水平的比较 根据IVF-ET术后14天监测血β-hCG升高情况，将收集标本中已进行移植的患者分为妊娠组及非妊娠组各17例，使用流式细胞仪检测两组间Cx37的表达量存在统计学差异(P<0.05)，妊娠组Cx37表达低于未妊娠组。见表1及图1。

表1 妊娠组与非妊娠组Cx37表达量的比较

图1 (图为流式细胞术散点图，Q3象限蓝色散点为Cx37阳性表达，Q4象限红点散点为实验阴性对照组分布范围，Q4象限蓝色散点为Cx37阴性表达)

2.3Cx37的表达与hCG日孕酮水平的相关性研究 Cx37的表达与hCG日孕酮水平呈正相关(r=0.301，P<0.05)。

2.4Cx37的表达与hCG日雌二醇水平的相关性研究 Cx37的表达与hCG日雌二醇水平呈正相关(r=0.293，P<0.05)。

2.5患者一般情况的比较 将IVF-ET术后妊娠组与未妊娠组患者一般情况比较，差异无统计学意义(P>0.05)；MⅡ卵率在组间比较，差异有统计学意义(P<0.05);hCG日孕酮、雌二醇表达在组间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 妊娠组与非妊娠组患者一般情况比较

3 讨 论

卵泡是卵巢的基本结构和功能单位，由一个卵母细胞及包围卵母细胞的颗粒细胞及卵泡膜细胞组成，在卵泡成熟过程中，最关键的是卵母细胞成熟。其中颗粒细胞间没有直接的血液供应，卵泡基膜将颗粒细胞、需要与临近的颗粒细胞及卵母细胞接触的血管化的卵泡膜细胞分开。故可将与基膜、卵母细胞整合的密集的间隙连接更显重要[5]。卵泡发育过程中，透明带允许与之相连的卵丘细胞与卵母细胞通过间隙连接传递信息[6,7,8]。同样，在Tsai等人研究发现卵母细胞减数分裂的启动与停止、颗粒细胞与卵母细胞之间的营养及代谢产物的传递与间隙连接蛋白息息相关[9]。Simon AM的研究显示，Cx37是连接卵母细胞与其周围颗粒细胞之间的主要连接蛋白，敲除这一基因，将导致卵母细胞与颗粒细胞之间通讯受阻，导致卵子的凋亡和卵泡的过早黄素化[6]。而在稍后的研究中，Wassarman等人发现Cx37的表达水平与卵母细胞的发育及减数分裂的完成相关[10]。早期有研究表明Cx37与卵泡发育有明显的相关性，尤其在卵泡发育中期达到最大值[11]。临床工作中，由于E2的合成与主导卵泡发育有关，使用辅助生殖技术助孕时，外周血E2水平是评价卵泡成熟最有意义的指标、促排卵过程中重要的监测指标，也是反应卵巢反应性的指标之一[12]。孕激素可抑制子宫内膜进一步不断增殖，使其转化为分泌的状态，为生殖胚泡的植入做好准备，同时也可维持妊娠状态。目前在各项研究中尚无法明确超促排卵过程中，hCG日血孕酮值在超过某一临界水平后，妊娠率是否会显著下降。有文献分析，孕酮水平的升高致临床妊娠率的下降原因可能是孕酮水平提前升高影响了内膜的容受性[13]，而Bosche E[4]的研究并表示未发现其相关性。陈骞等人[12]的研究中雌二醇水平升高的实验组在获卵数增加时，卵子和胚胎的质量并没有显著影响。本研究采用流式细胞术分析CX37与MⅡ卵率的相关性，得到MⅡ卵率与Cx37在颗粒细胞膜上的表达呈负相关，而根据分组比较得到妊娠组Cx37的表达低于非妊娠组，提示排卵前Cx37表达下降预示着卵母细胞相对成熟。本研究结果说明Cx37作为预测MⅡ卵的发生、以期预测卵泡成熟率有一定的意义。hCG日孕酮及雌二醇均与Cx37的表达呈正相关，但因二者指标同时与卵泡发育个数有关，暂无法明确Cx37是否可预测孕酮及雌二醇的表达量。同时根据移植术后14天测定的hCG值将患者分组为妊娠组及非妊娠组，发现Cx37的含量与孕酮及雌二醇无统计学意义。目前尚缺乏对于颗粒细胞上Cx37表达的研究，本研究采用流式细胞术，现临床多用于白血病诊断及分类，但其快速、仅需少量样本即可检测等特点应多加应用，尤其在不孕不育患者中，部分患者取卵量少，增加评估质量的难度，这些通过流式细胞术均可弥补。

综上所述，通过对卵泡液中颗粒细胞膜表面间隙连接蛋白37的检测，发现其表达与MⅡ卵率、IVF-ET后生化妊娠存在相关性，流式细胞术定量测定Cx37用于临床，可对卵泡成熟作出快速诊断，并以期预测妊娠率。