新型抗酸杆菌集菌法临床应用效果研究

邹 红,李剑鸿,陈 果,王晓燕，陈晓帆,李 厂

湖南省湘潭市第一人民医院检验科，湖南湘潭 411101

结核病是全球十大死因之一，据WHO统计，2017年全球约有1 010万结核病发病病例，而我国作为结核病高负担国家，结核病防治工作形势十分严峻[1-2]，早发现、早诊断是减少结核病传播，控制疫情的关键[3-4]。痰涂片抗酸染色显微镜检查是“十三五”全国结核病防治规划实施中的一个重要组成部分，也是诊断结核病最基本的病原学检查方法。由于痰涂片抗酸染色直接镜检阳性率较低[5-6]，不同种类的集菌法能提高痰抗酸杆菌阳性率[7-9]，且各有优劣势，本研究以新型抗酸杆菌集菌法检测痰标本中的抗酸杆菌，以液基夹层杯法和直接涂片抗酸染色法为对比，发现新型抗酸杆菌集菌法可以提高抗酸杆菌的阳性检出率，且通过对原始标本的灭活处理可提高生物安全操作性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本来源 416例肺结核患者来自2019年1月1日至2020年5月15日在湘潭市岳塘区管理的传染病信息报告系统结核病管理系统中登记在案的病例，诊断依据符合中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断标准：WS288-2017[10]。按照肺结核患者的管理要求留取痰标本。初诊失败指初诊肺结核患者治疗第5个月末或疗程结束时, 痰涂片或培养检查阳性,或涂阴患者治疗过程中出现痰检阳性。复治失败指复治涂阳肺结核患者治疗第5个月末或疗程结束时,痰涂片或培养检查阳性。其他属于8个月末之后的时间段。

1.1.2仪器与试剂 液基夹层杯法抗酸染色液、彭氏夹层杯、消化灭活液、取片针、TQ-12自动离心机均由湖南天骑公司提供；改进型抗酸染色消化集菌液，2%的NaOH(购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司)和3%的N-乙酰L-半胱氨酸(购自上海阿拉丁有限公司)混合液由本实验室自配；直接涂片抗酸染色液购自珠海贝索生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1检测方法 液基夹层杯法严格按照液基夹层杯抗酸染色试剂盒说明书步骤操作。新型抗酸杆菌集菌法操作步骤如下：于干净玻璃试管中按标本和改进型抗酸染色消化集菌的比例1∶(2～4)倍的量加入后震荡15 s，置78 ℃的水浴箱中20 min后，4 500 r/min离心5 min，弃上清液取沉渣涂片，干片后火焰来回3次固定，再用抗酸染色脱色液冲洗一遍，然后严格按照萋尼氏染色显微镜镜检。为保证结果的可比性，同一份痰标本使用液基夹层杯法和新型抗酸杆菌集菌法操作时保证均为1 mL左右的量。直接涂片法参照《中国结核病防治规划:痰涂片镜检质量保证手册》[11]操作。

1.2.2质量控制 痰标本抗酸染色镜检质量控制参照《中国结核病防治规划:痰涂片镜检质量保证手册》[11]执行。

1.2.3新型抗酸杆菌集菌法安全性试验 10份直接涂片抗酸阳性(++++)的标本，5份BD960液体培养结核分枝杆菌阳性的标本，设定不同配比的消化集菌液及水浴时间后，再接种至BD960液体培养基观察分枝杆菌生长情况，评价新型抗酸杆菌集菌法灭活集菌的安全性。

1.3统计学处理 采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计数资料以率表示，采用配对χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.13种方法阳性检出率 416例肺结核患者痰标本同时采用3种方法处理，同一患者同一份痰标本任意一种方法阳性判断为病原学阳性患者。新型抗酸杆菌集菌法、液基夹层杯法、直接涂片抗酸染色法抗酸杆菌的阳性检出率分别为44.7%(186/416)、40.1%(167/416)、26.2%(109/416)。

2.2新型抗酸杆菌集菌法和直接涂片抗酸染色法阳性检出率比较 新型抗酸杆菌集菌法和直接涂片抗酸染色法阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=69.59，P<0.05)。见表1。

表1 新型抗酸杆菌集菌法和直接涂片抗酸染色法阳性检出情况比较(n)

2.3液基夹层杯法和直接涂片抗酸染色法阳性检出率比较 液基夹层杯法和直接涂片抗酸染色法阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=46.40，P<0.05)。见表2。

表2 液基夹层杯法和直接涂片抗酸染色法阳性检出情况比较(n)

2.4新型抗酸杆菌集菌法和液基夹层杯法阳性检出率比较 新型抗酸杆菌集菌法和液基夹层杯法阳性检出率比较，差异有统计学意义(χ2=11.17，P<0.05)。见表3。

2.5初治或复治失败患者新型抗酸杆菌集菌法和液基夹层杯法检出比较 以新型抗酸杆菌集菌法检出阳性为对照，对10例初治或复治失败患者不同时间段的痰标本进行随访跟踪，发现在10例患者中，随着治疗时间的推移，在观察时间段内，新型抗酸杆菌集菌法均可以检出，而液基夹层杯法漏检8例。见表4。

表3 新型抗酸杆菌集菌法和液基夹层杯法阳性检出情况比较(n)

表4 10例初治或复治失败患者新型抗酸杆菌集菌法和液基夹层杯法检出比较

2.6新型抗酸杆菌集菌法安全性试验 10份直接涂片抗酸阳性(++++)的标本，5份BD960液体培养结核分枝杆菌阳性的标本经2%NaOH和3%N-乙酰L-半胱氨酸混合液消化，再78 ℃水浴15～20 min后，接种BD960液体培养42 d后未报阳，未见抗酸杆菌生长。而78 ℃水浴时间不足或NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比不当的处理方式均有抗酸杆菌生长。见表5。

表5 不同NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比及水浴时间的安全性试验结果

3 讨 论

抗酸染色至今仍是结核病细菌学诊断的主要方法之一，然而痰直接涂片抗酸染色镜检灵敏度低，通常痰液中分枝杆菌的浓度达到每毫升5 000～10 000条时才能得到阳性结果，如何提高痰涂片抗酸杆菌镜检的灵敏度对结核患者的细菌学检测工作具有重大意义。本研究课题组前期通过试验验证不同浓度的NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸消化液，在78 ℃左右(不超过80 ℃)水浴不同时间，新型抗酸杆菌集菌法安全有效的操作标准后，开始对临床标本做新型抗酸杆菌集菌法临床应用效果的研究。78 ℃水浴温度的选择考虑了结核分枝杆菌对湿热的灵敏度，然而痰标本如果不液化处理就达不到湿热对抗酸杆菌的杀灭效果；痰标本的液化处理采用的N-乙酰L-半胱氨酸在高于80 ℃时易失活，单纯的N-乙酰L-半胱氨酸对痰液化效果不理想，且结核分枝杆菌对一定浓度的NaOH有抵抗力，本研究通过试验确定了理想的NaOH和N-乙酰L-半胱氨酸配比及水浴温度和时间。结核分枝杆菌的抵抗力在中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断:WS288-2017附录A肺结核病原学中有提及[10]。

本研究结果显示，新型抗酸杆菌集菌法抗酸杆菌阳性检出率要优于液基夹层杯法和直接涂片抗酸染色法。液基夹层杯法、新型抗酸杆菌集菌法与直接涂片抗酸染色法两两比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。其原因分析如下：分枝杆菌抗酸性的强弱除与细胞壁的完整性有关以外，还与其细胞成熟和衰老程度有关。抗酸染色的原理是分枝杆菌含有分枝菌酸，可与苯酚复红牢固结合，不易被酸性乙醇脱色。分枝杆菌抗酸性是菌体内分枝菌酸、RNA蛋白及细胞壁的完整性相结合的综合反应。液基夹层杯法因采用集菌法能提高痰抗酸杆菌阳性率[12-15]。然而液基夹层杯法使用的消化液在对分枝杆菌的菌体灭活的同时也影响抗酸杆菌的着色性及集菌效果，且由于液基夹层杯法操作时对背景细胞的破坏严重，观察视野背景为白色，比较刺眼，不利于观察者的观察，容易造成漏检，使得液基夹层杯法检出阳性率(40.1%)稍低于新型抗酸杆菌集菌法(44.7%)。 笔者发现部分初治或复治失败患者的痰标本在直接涂片抗酸染色阳性的情况下，液基夹层杯法是阴性，而新型抗酸杆菌集菌法因采用对抗酸杆菌菌体损伤较小的化学法和对抗酸杆菌抗酸性没有影响的物理方法，达到集菌的目的，从而除适用于初诊和疑似患者的痰标本之外，也适合于初治失败或复治患者的随访跟踪。本研究跟踪10例初治或复治失败患者不同时间段的痰标本，发现在10例患者中，随着治疗时间的推移，在观察的时间段内与新型抗酸杆菌集菌法相比，液基夹层杯法漏检8例。刘燕文等[12]研究也显示，某些长期服用抗结核药物的患者其结核分枝杆菌抗酸性减弱，加上消化液对菌体的影响使得用液基夹层杯法检测变成阴性。

从阳性片阅片的时间成本上比较，同一患者同一份痰标本因集菌法提高了每视野中抗酸杆菌的菌量，需要观察的视野数可以减少，阅片视野数在中华人民共和国卫生行业标准-肺结核诊断:WS288-2017附录B分枝杆菌细菌学检查中有提及[10]，能明显减轻观察者的负担。阴性片的阅片时间没有差异。

直接涂片抗酸染色法相较于新型抗酸杆菌集菌法和液基夹层杯法虽然阳性检出率要低，但是也存在对于同一份标本直接涂片抗酸染色阳性而其他2种方法阴性的情况，这与抗酸杆菌菌量很少，且抗酸杆菌在标本中分布有一定的聚集性有关。虽然集菌法也存在漏检，但标本量使用多的集菌法漏检的概率会小得多。

本研究的不足之处：因抗酸杆菌的涂片镜检存在死菌依然阳性的情况，10例初治或复治失败抗酸杆菌涂片阳性患者未用同一份标本做结核培养甚至有未做培养的情况。

综上所述，新型抗酸杆菌集菌法具有快速、简单、生物安全性高、检出率高的优势，优于直接涂片抗酸染色法及液基夹层杯法。