基于网络药理学对马鞭草-青蒿药干预新型冠状病毒肺炎的物质基础与作用机制研究

蔡孟成，金永生

新型冠状病毒肺炎对人类健康造成了极大威胁，根据中国中药组分库数据显示，马鞭草对于冠状病毒引起的肺部损伤，特别是小气道损伤、微血栓具有很强的活性；同时，国家卫健委发布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》也将青蒿和马鞭草纳入治疗普通型湿毒郁肺证的中药药方[1-2]。本文旨在通过对马鞭草-青蒿进行网络药理学分析，以期明确其物质基础及可能的作用机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1药物相关靶点的筛选 本研究采用生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索中药马鞭草、青蒿的活性成分及靶点。根据化合物口服生物利用度(OB)≥30%与类药性(DL)≥0.18进行筛选[3-4]。

1.2构建化合物-靶点网络 以novel coronavirus pneumonia为关键词检索GeneCard (https://www.genecards.org/)数据库收集与新型冠状病毒肺炎相关的作用靶点。将“1.1”中成分靶点与疾病靶点进行交集。为明确疾病相关靶点与马鞭草-青蒿药对相关靶点之间的关系，将上述两部分靶点进行交集，输入Cytoscape3.6.1软件构建出化合物-靶点网络。Cytoscape软件的核心架构是网络，每个节点是基因、蛋白质或分子，节点与节点之间的连接代表这些生物分子之间的相互作用，节点的度值代表网络中节点与节点相连的数目。

1.3构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络 为更深层次探究靶点蛋白之间的相互作用，将统计所得的疾病-药物靶点基因上传至在线STRING10.5软件(http://string db.org)，构建PPI网络模型。物种选择为人(Homosapiens)，参数保持默认设置，获取PPI网络。

1.4生物过程与通路分析 利用R Project中的org.Hs.eg.db程序包(http://www.bioconductor.org /packages/release/data/annotation/html/org.Hs.eg.db.html)将基因symbols转变为Entrez IDs，进而利用clusterProfiler程序包(3.6版)(http://bioconductor.org/packages /release/bioc/html/clusterProfiler.html)对网络进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，保存结果。设定阈值P<0.05，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，筛选GO富集分析中分子功能、细胞组成和生物过程的前10个条目以及KEGG富集的前20个信号通路。

2 结果

2.1筛选药物活性成分 通过TCMSP检索到马鞭草、青蒿中化合物共184个：其中58个来自马鞭草，126个来自青蒿。以OB≥30%且DL≥0.18筛选出化合物34个：其中12个来自马鞭草，22个来自青蒿。其中MOL005229-蒿黄素、MOL000449-豆甾醇、MOL000422-山柰酚、MOL000098-槲皮素、MOL000006-木樨草素为青蒿与马鞭草的共有成分。部分化合物见表1。

表1 马鞭草-青蒿部分活性成分

2.2化合物-靶点相互作用网络构建 采用Cytoscape3.6.1软件构建的化合物-靶点网络包含23个化合物节点、43个靶点节点和135条边，用红色节点表示青蒿与马鞭草的活性成分，绿色节点表示疾病靶点，连接化合物与靶点的边表示他们之间有作用关系(图1)。依据网络拓扑学性质可知，有较多节点的化合物或药物靶点在整个网络中可能起到关键的作用，因此本研究筛选节点度较大的节点进行分析。排名前五位的化合物分别为槲皮素(quercetin)、木樨草素(luteolin)、山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、β-胡萝卜素(beta-carotene)，分别能与38、18、13、7、6个靶点蛋白发生作用。从靶点的角度看，度值排名前5位的是前列腺素过氧化物合酶2(PTGS2)、前列腺素过氧化物合酶1(PTGS1)、一氧化氮合酶(NOS2)、过氧化物酶体增生激活受体γ(PPARG)、丝裂原活化蛋白激酶14(MAPK14)，分别能与22、14、14、10和6个化合物发生相互作用，体现了中药多靶点的特性。

图1 马鞭草-青蒿主要成分-靶点相互作用网络

2.3马鞭草-青蒿靶点PPI网络的构建与分析 应用STRING10.5软件构建PPI网络，其中包含节点43个，1094条边，同时得到网络中关键靶点的频次(图2)。根据“度值>均值”筛选出关键节点25个，包括：IL6、MAPK8、CASP3、IL10、CXCL8、MAPK1、ALB、CCL2、IL1B、PTGS2、IFNG、IL4、FOS、ICAM1、MAPK14、RELA、IL2、CASP8、EGFR、STAT1、BCL2L1、HMOX1、NOS2、PPARG、CXCL10。度值最高的是IL6和MAPK8，为38；其次为CASP3，度值为37；IL10度值为36。度值大的靶点提示在网络调控中起着关键作用，可能是马鞭草-青蒿治疗新型冠状病毒肺炎的关键靶点。

图2 马鞭草-青蒿中关键靶点频次

2.4GO富集与KEGG通路富集分析 GO生物过程条目主要包括：对脂多糖的反应，脂多糖的细胞反应，外源性凋亡信号通路以及应答氧化压力等；分子功能包括：细胞因子结合、细胞因子活性、受体配体活性、BH结构域结合以及死亡结构域结合；并且参与了膜筏、膜微小结构、空腔等结构的组成。KEGG富集信号通路主要包括：细胞因子-细胞因子受体及结合信号通路、HIF-1信号通路、MAPK信号通路、NF-κ B信号通路、凋亡信号通路等。见图3。

图3 马鞭草-青蒿抗新型冠状病毒肺炎KEGG富集分析的气泡图

3 讨论

中医学认为新型冠状病毒肺炎属于湿热疫的范畴，在治疗方法上应当清热利湿[5-7]。青蒿味苦、辛，性寒，归肝胆经，具有清虚热、除骨蒸、解暑热的功效，临床常用于治疗温邪伤阴、骨蒸痨热等病症，主要针对新型冠状病毒肺炎中“热”的特点；马鞭草味苦，性凉，归肝脾经，具有利水消肿、清利湿热、活血散瘀的功效，主治湿热水肿、外感发热等病症，主要针对新型冠状病毒肺炎中“湿”的特点。《江苏验方草药选编》中记载马鞭草配伍青蒿与羌活可以治疗伤风感冒，可见，马鞭草-青蒿药基于中医理论对治疗新型冠状病毒肺炎具有一定疗效。

现代医学认为新型冠状病毒肺炎是由新型冠状病毒感染导致的，故而抗病毒已成为治疗的重要举措，利巴韦林、洛匹那韦等抗病毒药物已经应用于临床。中药复方相对于西药而言具有多靶点、低毒性的特点。现代实验研究表明，马鞭草对鸡新城疫病毒有直接的灭活作用，其机制可能是通过抑制其生物合成实现[8]。青蒿中的青蒿挥发油——羟丙基-β-环糊精可以抑制呼吸道合胞病毒，柯萨奇病毒A16型的活性[9]；青蒿琥酯能显著抑制乙型肝炎病毒抗原的表达[10]；青蒿鞣质对单纯疱疹病毒具有明显的直接杀灭作用，可以阻断病毒的吸附过程并抑制病毒在细胞内的复制[11]；刘桂梅等[12]也探讨了青蒿素及其衍生物用于治疗新型冠状病毒肺炎的可行性。可见，马鞭草-青蒿药对通过有效成分的相互作用可能能够发挥新型冠状病毒的灭活作用。

现代药物化学研究表明，马鞭草中含有山柰酚、芹菜素、槲皮素、木樨草素、异鼠李素、毛蕊花糖苷、马鞭草苷、β-谷甾醇等化合物[13]；青蒿中含有青蒿素、β-谷甾醇、芹菜素、山柰酚、槲皮素、木樨草素、泽兰林素等活性成分[14]。本研究表明，马鞭草-青蒿药对抗新型冠状病毒肺炎的主要活性成分可能是槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇、β-胡萝卜素。槲皮素可以与F蛋白相互作用阻断病毒的黏附，发挥抗人呼吸道合胞病毒的作用[15]；木樨草素可通过干扰外壳蛋白I复合物的表达降低甲型流感病毒的含量[16]；β-胡萝卜素对腺病毒转化的293细胞和人类疱疹病毒转化的Raji细胞的增殖具有明显的抑制作用，对293细胞内整合的腺病毒早期基因的表达具有下调作用[17]。由此可见，槲皮素、木樨草素与β-胡萝卜素可能是抗病毒的主要活性成分。

基于目前的临床调查，新型冠状病毒肺炎的严重程度与病毒和机体炎症反应的强度相关，随着疾病进展，如果患者体内出现过度的炎症反应，即“细胞因子风暴”，将可能导致肺上皮细胞和内皮细胞大量凋亡最终引起急性肺损伤与呼吸窘迫综合征等，故重期与危重期急需抗炎治疗[18]。山柰酚可以减轻脂多糖导致的小鼠急性肺损伤，其机制可能是通过抑制肺组织促炎因子NF-κB、IL-1β、HO-1、PTGEs、iNOS、TNF-α和COX-2 mRNA的表达和促进抗炎因子HO-1 mRNA的表达而发挥保护作用[19]；β-谷甾醇可调节小鼠巨噬细胞极化并减轻炎症反应，其与阿司匹林合用具有协同效应[20-21]。此外，槲皮素、木樨草素、β-胡萝卜素也具有抗炎活性[22-23]。可见马鞭草-青蒿药从理论上可以配伍其他药物应用于新型冠状病毒肺炎的重期与危重期。

PPI网络结果显示，关键节点主要分为炎性介质和丝裂原活化蛋白激酶等。其中以炎性介质数量最多。马鞭草-青蒿药可能是通过降低白介素、肿瘤坏死因子等炎性因子的分泌水平，调节巨噬细胞的极化，清除自由基等机制发挥抗炎作用[24-25]。GO生物过程富集涉及炎症应答最为关键，此外还涉及氧化还原过程、蛋白表达等；其还在细胞膜、细胞质发生蛋白结合、ATP结合、酶反应等分子反应。KEGG分析表明，马鞭草-青蒿药作用通路主要与抗炎相关，如细胞因子-细胞因子受体及结合信号通路可直接调控IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ；HIF-1信号通路可调控PTK、ERK、PKC；NF-κB信号通路可调控IL-1β、PKCβ发挥抗炎作用[13-14]。此外，马鞭草-青蒿药还涉及抗病毒免疫调节通路。

综上所述，基于目前数据库中已有的相关结果，马鞭草-青蒿药对治疗新型冠状病毒肺炎的有效成分可能是槲皮素、木樨草素、山柰酚、β-谷甾醇和β-胡萝卜素，这些成分通过炎症相关靶点参与细胞因子-细胞因子受体及结合信号通路、HIF-1信号通路、NF-κB信号通路等，发挥抗病毒、抗炎和免疫调节的作用。本研究结果与现有的COVID-19研究结果相吻合。但网络药理学的预测存在局限性，本研究提出的活性成分、靶点以及通路仍需后期更多的实验加以验证。