循环肿瘤细胞在评估传统及胸腔镜辅助肺癌切除术治疗早期非小细胞肺癌效果的应用

屈志刚，李金波，胡亚锋，伍 光，田 彦

肺癌是严重威胁人类健康的疾病，其病死率居所有恶性肿瘤之首[1-2]。早期手术切除是肺癌最重要的治疗方法之一，但部分患者仍存在肿瘤复发或远处转移。研究发现循环肿瘤细胞(circulating tumor cells， CTCs)与肺癌分期、发生远处转移，甚至与肺癌术后长期生存率密切相关[3]；CTCs不仅可有效判断肺癌患者预后，还能预测和监测辅助治疗效果[4-5]。随着微创技术的进步，除传统开胸肿瘤切除外，肺癌外科治疗还包括电视胸腔镜肿瘤切除(video-assisted thoracoscopic surgery， VATS)，可通过三孔法和单孔法实施[6]。本研究旨在检测非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinoma, NSCLC)患者围术期行传统开胸手术及单孔、三孔VATS过程中CTCs水平变化，明确不同手术方式与患者临床预后的关系。

1 资料与方法

1.1临床资料 收集2014年8月—2018年2月于河北省涿州市医院行肺癌切除术的NSCLC 61例，其中传统手术组24例，单孔VATS组16例，三孔VATS组21例。纳入标准：年龄18～80岁；术前或术后病理证实为NSCLC；术前未经放、化疗治疗。排除标准：有其他恶性肿瘤病史；术前已接受放、化疗治疗。VATS手术操作步骤：患者采用全麻，双腔气管插管、健侧单肺通气，健侧卧位，单孔法采用腋前线第4或5肋间切口(约4 cm)作为操作口，腋后线第7肋间切口(1.5 cm)作为观察口；三孔法在肩胛下角线第7肋间增加1个切口(约2 cm)作辅助操作孔，VATS均为同一术者完成。为避免CTCs播散，操作时先结扎肺静脉，后结扎肺动脉；先清除肺门及叶尖淋巴结，后清扫肺内淋巴结。此外，研究招募10例良性肺疾病患者及15名健康志愿者作为CTCs检测的阴性对照组。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2围术期CTCs检测 分别于术前2 d，术中肺叶切除、淋巴结清扫后，术后2 d采集上述3组肘正中静脉外周血标本，其中前2 ml用于检测肿瘤标记物，后7.5 ml用于CTCs检测。血标本采集后置于柠檬酸抗凝管，4℃保存，18 h内进行CTCs检测。

1.2.1采用免疫磁珠法富集CTCs：7.5 ml抗凝全血与等比例PBS充分混匀，加7.5 ml人淋巴细胞分离液，室温800×g离心20 min，弃上清、收集第二层细胞，加5 ml PBS，室温800×g离心20 min，将细胞沉淀重悬于80 μl磁珠缓冲液，加20 μl CD45抗体(Miltenyi Biotec，德国)，混匀后4℃孵育15 min，加2 ml磁珠缓冲液，800×g室温离心10 min，弃上清，加入500 μl磁珠缓冲液混匀并重悬；将细胞重悬液过磁珠MS分流柱，重复2次，收集从分流柱下流出的液体，800×g室温离心10 min。

1.2.2采用Envision法检测CTCs：将细胞悬液均匀涂于载玻片,室温下风干，用4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗，擦去多余水分，滴加小鼠抗人Pan-CK抗体(1∶100，Cell Signaling，美国)，4℃冰箱过夜；PBS清洗后用滤纸擦去多余水分，加Envision二抗(中杉金桥，中国)，37℃恒温孵育20 min；DAB显色，苏木素复染，酸乙醇分化、脱水，中性树胶封片；光学显微镜下观察、照相。

1.2.3CTCs细胞形态学判定标准：细胞呈圆形、椭圆形或长形，长径>10 μm；光镜下可见完整细胞形态及细胞核。CTCs细胞光镜学标准：有完整细胞膜，Pan-CK染色阳性，胞浆呈蓝黑色或褐色；细胞长径>10 μm；核浆比失常。结果判定：由两位经培训实验员在光镜下独立观察细胞并采集相关图像，有分歧时由两人共同判定结果[7]。

2 结果

2.1NSCLC临床病理特征及CTCs检查 本研究共纳入61例患者，传统手术组包括腺鳞癌、大细胞癌各1例，单孔VATS组包括腺鳞癌1例，三孔VATS组包括肺泡细胞癌1例。3组年龄、性别、肿瘤组织类型、吸烟史及临床分期比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。61例NSCLC共有44例血标本检测出2个以上CTCs(图1)，检测阳性率为72.1%，良性肺疾病患者及健康志愿者未检测出存在CTCs。

图1 NSCLC及健康志愿者外周血CTCs检测(Pan-CK×400)A.NSCLC患者，B.健康志愿者；*代表CTCs，NSCLC为非小细胞肺癌，CTCs为循环肿瘤细胞

表1 3组NSCLC临床病理特点

2.2围术期CTCs变化 术前2 d、手术当日3组CTCs数量比较差异无统计学意义(P>0.05)；传统手术组术后2 d CTCs数量显著多于单孔和三孔VATS组(P<0.05)。见表2，图2。

表2 3组NSCLC围术期CTCs数量比较个/5 ml)

图2 不同术式对NSCLC围术期CTCs数量的影响NSCLC为非小细胞肺癌，CTCs为循环肿瘤细胞，VATS为电视胸腔镜肿瘤切除；与单孔VATS组比较，aP<0.05;与三孔VATS组比较，cP<0.05

2.3不同肺癌切除术式对围术期CTCs增高情况的影响 3组术前2 d至手术当日所测CTCs数量增高情况不明显(P>0.05)；传统手术组术前2 d至术后2 d CTCs数量增高情况高于单孔及三孔VATS组(P<0.05)，而三孔VATS组CTCs数量增高最少。见表3。

表3 3组NSCLC围术期CTCs数量增高情况比较个/5 ml)

3 讨论

原发性支气管肺癌是我国最常见、病死率最高的恶性肿瘤之一，对早期NSCLC进行外科手术切除是治疗的重要手段，然而患者5年复发率仍高达30%。初诊时的常规检查方法无法探测出的隐匿转移灶是早期肺癌切除术后肿瘤复发的重要原因[8]。通过淋巴结或循环系统的转移途径进入血液循环成为CTCs是肺癌全身转移的重要环节。近年来CTCs作为液体活检标本，其定量、动态测量逐渐作为监测肿瘤细胞复发转移及评估疗效和预后的重要手段[9-10]。

微创手术已成为治疗早期肺癌的有效手段，随着手术技术的不断完善，由三孔法逐渐改进为可以通过单孔进行VATS。临床研究报道，VATS相比传统开胸手术存在创伤小、并发症发生率低、住院时间短、恢复快等优点。然而手术带来的围术期CTCs的变化尚未可知。本研究通过免疫磁珠法和免疫细胞化学染色法(Envision法)对传统手术、单孔和三孔法VATS NSCLC患者围术期CTCs进行检测发现，传统手术组术后2 d CTCs数量显著多于单孔和三孔VATS组。提示外科手术不可避免地带来围术期CTCs数量增加，然而微创VATS手术比传统开胸手术较少引起CTCs的增加。

CTCs在血液循环中存在数量极少，每106～107白细胞中仅能发现1个CTCs，为了增加其检出率，我们通过免疫磁珠法对其进行富集。通过制备CD45抗体的免疫磁珠，与CTCs表面上皮细胞黏附分子(EpCAM)抗原结合成为CTCs-抗原/抗体-磁珠复合物，于外在磁场作用下向一定方向移动，从而富集CTCs，再通过Envision法对CTCs进行检测[11]。本研究中72.1%患者检测出CTCs，接近既往研究中CTCs的检测阳性率[12-13]。

尽管手术先结扎肺静脉，外科机械性操作均不可避免地释放部分CTCs入外周血，形成CTCs。本研究结果显示，传统手术组术前2 d至术后2 d CTCs数量增高情况高于单孔及三孔VATS组。提示胸腔镜下更好的手术视野、较轻微的机械性操作可能对CTCs变化影响不大；此外，VATS较少刺激免疫系统、进而较少刺激肿瘤细胞增殖可能是CTCs变化较少的原因。其中，三孔VATS操作引起的变化最少[12]。

尽管CTCs的数量与患者远期复发转移的关系尚无明确结论，避免围术期CTCs的波动仍是手术的目标之一[14]，本研究明确了VATS在较少干扰CTCs方面的优势，尤其三孔法不仅可保证淋巴结清扫效果、减轻围术期并发症，还显著减少了CTCs的增加，具有较大优势。