miR-103a-3p靶向RCAN1对MPP+诱导的帕金森病细胞模型损伤的影响及机制研究

徐向玲，李 强，李春梅，孙巧丽

帕金森病(parkinson's disease， PD)是常见于中老年人的神经退行性疾病，表现为运动和认知功能障碍，包括静息性震颤、运动迟缓、姿势步态异常、精神和感觉障碍等[1-2]。目前，PD主要是对症治疗。有报道指出PD发生可能与神经元凋亡有关[3-4]，因此研究神经元凋亡分子机制可能为PD治疗提供新靶点。miRNA是一种非编码RNA，其通过与靶基因3'-UTR结合在转录后水平调控基因表达[5-6]。既往研究显示，miR-212[7]、miR-34a[8]等多种miRNA在PD的发生发展中起着重要作用。miR-103a-3p位于染色体5q34，与肿瘤[9]、PD[10]和妊娠相关并发症[11]的发生有关。生物信息学分析显示，钙调蛋白1(regulator of calcineurin 1， RCAN1)是miR-103a-3p的潜在功能性靶基因。许多研究表明，RCAN1表达的增加通过促进神经元凋亡在阿尔茨海默病的发病机制中起关键作用[12-13]。但miR-103a-3p能否靶向RCAN1参与PD进展尚未可知。1-甲基-4-苯基碘化吡啶(1-methyl-4-phenylpyridinium ion， MPP+)是一种常用的多巴胺神经元毒物，可导致线粒体膜的缺失以及活性氧形成，最终导致神经元细胞凋亡，其诱导的SK-N-SH是常用的PD体外细胞模型[14]。本研究旨在探讨miR-103a-3p靶向RCAN1在MPP+诱导的神经母细胞瘤细胞SK-N-SH凋亡中的作用，以期为PD治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1实验材料 神经母细胞瘤细胞SK-N-SH购于上海名劲生物科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清、青链霉素溶液购于美国Gibco公司；MPP+购于美国Sigma公司；细胞计数(Cell Counting Kit 8， CCK-8)试剂盒、膜联蛋白V异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)试剂盒、Trizol试剂购于上海碧云天生物科技有限公司；Omniscript RT试剂盒购于上海力敏实业有限公司；SYBR Green qPCR Mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司；兔源RCAN1、细胞周期素D1(CyclinD1)、活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Cleaved-caspase-3)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体购于美国Abcam公司；miR-103a-3p模拟物(miR-103a-3p mimics)及其阴性对照(miR-NC)、miR-103a-3p抑制物(anti-miR-103a-3p)及其阴性对照(anti-miR-NC)、RCAN1小干扰RNA(si-RCAN1)及其阴性对照(si-NC)、RCAN1过表达载体(pcDNA-RCAN1)及其阴性对照(pcDNA-NC)、PCR引物由上海生工生物工程有限公司提供。

1.2细胞培养 SK-N-SH细胞采用含10%胎牛血清、含1%青链霉素双抗的DMEM培养基于37℃，5% CO2条件下培养。

1.3不同浓度MPP+对SK-N-SH细胞存活的影响

1.3.1CCK-8法检测细胞存活情况：将SK-N-SH细胞按照2×103cells/孔，100 μl/孔接种到96孔板，将培养板放在培养箱预培养24 h，向培养板加入不同终浓度(0.1、0.2、0.4 mmol/L)的MPP+试剂于培养箱孵育24 h，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

1.3.2流式细胞术检测细胞凋亡情况：收集经不同终浓度(0.1、0.2、0.4 mmol/L)MPP+处理24 h的SK-N-SH细胞，PBS洗涤细胞2次，采用结合缓冲液重悬细胞，调整密度为1×106cells/ml。按照Annexin V-FITC/PI试剂盒步骤检测细胞凋亡情况。

1.4RT-qPCR检测miR-103a-3p和RCAN1 mRNA的表达 收集终浓度为0.2 mmol/L MPP+处理24 h的SK-N-SH细胞，Trizol法提取细胞总RNA。利用Omniscript RT试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，按照SYBR Green qPCR Mix说明进行RT-qPCR扩增。β-actin和U6分别作为RCAN1和miR-103a-3p的内源性对照，采用2-ΔΔCt法计算miR-103a-3p和RCAN1 mRNA表达量。引物序列(5'-3')：miR-103a-3p上游ATCCAGTGCGTGTCGTG，下游TGCTAGCAGCATTGTACAGG；U6上游GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，下游CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT；RCAN1上游GGTGGTCCACGTGTGTGAGA，下游ACGTGAACAAAGGCTGGTCCT；β-actin上游CCAACCGCGAGAAGATGA，下游CCAGAGGCGTACAGGGATAG。

1.5Western blot检测RCAN1蛋白的表达 收集终浓度为0.2 mmol/L的MPP+处理24 h的SK-N-SH细胞，RIPA裂解液提取各组细胞蛋白。BCA法测定蛋白浓度，取适量蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸3 min后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。将分离的细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜，4℃封闭过夜，分别加入稀释的RCAN1抗体、β-actin抗体杂交，洗膜后，加入相对应的二抗室温反应1 h，洗膜后，进行化学发光显色。采用凝胶成像系统分析各目的条带灰度值。以目标蛋白灰度值和β-actin灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。

1.6miR-103a-3p和RCAN1对SK-N-SH细胞增殖和凋亡的影响 将miR-NC、miR-103a-3p mimics、si-NC、si-RCAN1分别转染SK-N-SH细胞，采用0.2 mmol/L的MPP+处理24 h后，依次记为MPP++miR-NC组、MPP++miR-103a-3p组、MPP++si-NC组、MPP++si-RCAN1组。同时将miR-103a-3p mimics分别与pcDNA-NC、pcDNA-RCAN1共转染SK-N-SH细胞，转染MPP+处理24 h，依次记为MPP++miR-103a-3p+pcDNA-NC组、MPP++miR-103a-3p+pcDNA-RCAN1组，检测细胞活力和凋亡情况。将各组SK-N-SH细胞按照2×103cells/孔接种于96孔板，培养箱中预培养一段时间后，检测各组细胞活力，观察细胞存活情况。

1.7双荧光素酶报告基因实验验证RCAN1对miR-103a-3p的靶向作用 为证实miR-103a-3p对RCAN1的靶向作用，将含miR-103a-3p结合位点的野生型(WT-RCAN1)或含miR-103a-3p结合位点突变序列的突变型(MUT-RCAN1)荧光素酶报告基因载体分别与miR-NC、miR-103a-3p mimics共转染SK-N-SH细胞，24 h后收获细胞，按荧光素酶活性检测试剂盒说明书测定各组细胞荧光素酶活性。

2 结果

2.1不同浓度MPP+对SK-N-SH细胞存活和凋亡的影响 与NC组比较，不同浓度MPP+处理组SK-N-SH细胞的存活率显著降低，细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。选择0.2 mmol/L MPP+进行后续实验。见表1和图1。

图1 4组SK-N-SH细胞凋亡情况流式细胞仪检测结果MPP+为1-甲基-4-苯基碘化吡啶

表1 不同浓度MPP+对SK-N-SH细胞存活率和凋亡率的影响

2.2MPP+诱导的PD细胞模型SK-N-SH细胞中miR-103a-3p和RCAN1表达情况 与NC组比较，MPP+组SK-N-SH细胞miR-103a-3p的表达显著降低，RCAN1 mRNA和蛋白的表达显著升高(P<0.01)。见表2和图2。

图2 MPP+诱导的PD细胞模型SK-N-SH细胞中RCAN1蛋白的表达PD为帕金森病，MPP+为1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1为钙调蛋白1，β-actin为β-肌动蛋白

表2 MPP+诱导的PD细胞模型SK-N-SH细胞中miR-103a-3p和RCAN1表达情况

2.3过表达miR-103a-3p对PD细胞模型SK-N-SH细胞存活和凋亡的影响 与MPP++miR-NC组比较，MPP++miR-103a-3p组SK-N-SH细胞miR-103a-3p、CyclinD1蛋白表达、细胞存活率显著升高，Cleaved-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率显著降低(P<0.01)。见表3和图3。

表3 过表达miR-103a-3p对PD细胞模型SK-N-SH细胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达及细胞存活的影响

图3 过表达miR-103a-3p对PD细胞模型SK-N-SH细胞CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响PD为帕金森病，MPP+为1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1为钙调蛋白1，β-actin为β-肌动蛋白

2.4干扰RCAN1表达对PD细胞模型SK-N-SH细胞存活和凋亡的影响 与MPP++si-NC组比较，MPP++si-RCAN1组SK-N-SH细胞RCAN1、Cleaved-caspase-3蛋白表达、细胞凋亡率降低，CyclinD1蛋白表达和细胞存活率升高(P<0.01)。见表4和图4。

图4 PD细胞模型SK-N-SH细胞中RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达PD为帕金森病，MPP+为1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1为钙调蛋白1，CyclinD1为细胞周期素D1，Cleaved-caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3

表4 干扰RCAN1表达对PD细胞RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达及细胞模型SK-N-SH细胞存活的影响

2.5miR-103a-3p靶向RCAN1并调控其表达 采用starbase进行靶基因预测发现，miR-103a-3p与RCAN1的3'-UTR区域存在特异性结合的核苷酸序列，见图5A。Western Blot检测miR-103a-3p对RCAN1的调控作用显示，miR-NC组、miR-103a-3p minmics组、anti-miR-NC组、anti-miR-103a-3p组RCAN1蛋白表达水平分别为0.35±0.05、0.12±0.01、0.34±0.04、0.73±0.07。与miR-NC组比较，miR-103a-3p组SK-N-SH细胞RCAN1蛋白的表达显著降低(P<0.01)；与anti-miR-NC组比较，anti-miR-103a-3p组SK-N-SH细胞RCAN1蛋白的表达显著升高(P<0.01)，见图5B。双荧光素酶报告基因验证二者的靶向关系显示，与miR-NC和WT-RCAN1共转染组比较，miR-103a-3p mimics和WT-RCAN1共转染组SK-N-SH细胞的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；与miR-NC和MUT-RCAN1共转染组比较，miR-103a-3p mimics和MUT-RCAN1共转染组SK-N-SH细胞的荧光素酶活性变化无统计学意义(P>0.05)，见表5。提示在SK-N-SH细胞中miR-103a-3p靶向RCAN1并负调控其表达。

表5 2组SK-N-SH细胞双荧光素酶活性比较

图5 miR-103a-3p靶向SK-N-SH细胞中RCAN1、调控RCAN1蛋白的表达A.starbase对miR-103a-3p和RCAN1结合进行预测示意图；B.Western Blot检测RCAN1蛋白表达；RCAN1为钙调蛋白1，β-actin为β-肌动蛋白

2.6过表达RCAN1可部分逆转miR-103a-3p对PD细胞模型SK-N-SH细胞存活和凋亡的影响 与MPP++miR-103a-3p+pcDNA-NC组比较，MPP++miR-103a-3p+pcDNA-RCAN1组SK-N-SH细胞RCAN1、Cleaved-caspase-3蛋白的表达及凋亡率显著升高，CyclinD1蛋白的表达及细胞存活率显著降低(P<0.01)。见表6和图6。

图6 PD细胞损伤模型SK-N-SH细胞RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达情况PD为帕金森病，MPP+为1-甲基-4-苯基碘化吡啶，RCAN1为钙调蛋白1，CyclinD1为细胞周期素D1，Cleaved-caspase-3为活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3，β-actin为β-肌动蛋白

表6 过表达RCAN1可部分逆转miR-103a-3p对PD细胞损伤模型SK-N-SH细胞RCAN1、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达及细胞存活的影响

3 讨论

随着人类寿命的延长，PD作为一种神经退行性疾病引起了人们的广泛关注。大量证据表明包括PD在内的多种神经系统疾病中miRNA在调节多种基本生物学和病理学过程中发挥重要作用，且多种miRNA在PD患者或动物脑脊液中表达异常，参与多巴胺神经元发育[15]。因此，阐明miRNA在PD中的作用有望为PD的临床诊疗提供新的靶点。

miR-103a-3p的异常表达与多种神经系统疾病的发生相关。Chang等[16]通过对阿尔茨海默病miRNA差异表达分析发现，miR-103a-3p的表达显著下调。Liguori等[17]通过高通量测序和生物统计分析发现，肌萎缩性侧索硬化症患者外周血样品中miR-103a-3p也呈低表达。此外，Yu等[18]指出miR-103a-3p在神经胶质瘤组织和细胞中呈低表达，上调其表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，抑制神经胶质瘤恶性行为。为证实miR-103a-3p在PD中的作用，本研究采用MPP+诱导SK-N-SH，结果显示MPP+处理引起细胞存活率呈剂量依赖性降低，并诱导细胞凋亡增加，与既往MPP+诱导的细胞凋亡机制一致[19]，选择0.2 mmol/L MPP+进行建模。进一步研究发现，MPP+处理的SK-N-SH细胞中miR-103a-3p的表达显著下调，过表达miR-103a-3p可减轻MPP+处理对SK-N-SH细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用，逆转MPP+处理对CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响。以上研究说明过表达miR-103a-3p在MPP+诱导的PD细胞模型损伤中具有保护作用。Serafin等[10]报道miR-103a-3p在左旋多巴治疗PD患者外周血中表达上调，本研究结果与其一致。

RCAN1基因位于21号染色体上，由7个外显子和6个内含子组成。早期研究显示，阿尔茨海默病和唐氏综合征患者大脑组织中RCAN1表达增加，正常衰老的人脑组织中RCAN1表达水平也升高[20]。近年来多项研究指出，在衰老过程中RCAN1表达增加导致线粒体功能障碍和氧化应激，从而促进神经退行性变和阿尔茨海默病的发生[21-22]。本研究结果显示，MPP+诱导的PD细胞模型SK-N-SH细胞中RCAN1的表达显著增加。进一步探讨RCAN1在PD进展中作用发现干扰RCAN1表达可减轻MPP+诱导对SK-N-SH细胞的增殖抑制和凋亡促进作用，并减轻MPP+处理对CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表达的影响。随后的双荧光素酶报告基因分析和Western blot分析显示，miR-103a-3p以转录后的方式抑制RCAN1表达。此外，进一步恢复实验显示过表达可逆转miR-103a-3p对PD细胞损伤模型SK-N-SH细胞增殖、凋亡以及相关蛋白表达的影响。

综上所述，miR-103a-3p通过靶向RCAN1进而减弱MPP+诱导的神经元细胞凋亡，提示miR-103a-3p/RCAN1是PD诊疗的潜在靶点。然而，需要更多的体内数据来进一步验证miR-103a-3p/RCAN1分子轴在PD进展中的作用。