拿捕净胁迫对谷子愈伤组织AsA-GSH循环的影响

马春英，王玉玲，尹艺臻，温银元，原向阳，赵娟

（山西农业大学 农学院，山西 太谷030801）

谷子（Setaria italicaBeauv.）是禾本科狗尾草属最古老的作物之一［1］，在旱作生态农业中发挥重要作用，是新时期大众食品消费多元化需求和畜牧业发展的特色和优势作物，其种植面积发展稳定。但谷田杂草危害严重，导致减产，且谷子对除草剂较其它禾本科作物敏感，常用除草剂在谷田喷施时稍有不慎就会造成药害，严重制约着谷子规模化生产。因此，了解谷子抗除草剂响应机制，对谷田除草及培育抗除草剂品种具有重要意义。

拿捕净化学名称烯禾啶（Sethoxydim），属于环己烯酮类除草剂，是一种高活性、对多种一年生和多年生禾本科杂草有很强的选择性的内吸型茎叶处理剂，其除草效果明显，施后被杂草茎叶迅速吸收，使杂草生命活性降低，失去竞争力，且在土壤中易分解成安全物质，被较广泛地使用到生产中［2］。田伯红等［3］研究表明，谷子幼苗叶期喷施拿捕净可有效防除禾本科杂草，平均株防效达88.63%。解丽丽等［4］发现，在拿捕净胁迫下张杂谷5号叶片的SOD、POD酶活性增加，使谷子细胞免受活性氧造成的伤害。高爱保等［5］研究发现，拿捕净胁迫后抗性品种叶绿素含量、抗氧化酶活性高于敏感品种。植物受到逆境胁迫时，细胞内积累过量的活性氧（ROS），过量的ROS会引起植物细胞的氧化损伤，AsA-GSH循环系统是植物体内清 除ROS的 重 要 途 径［6］，在 此 循 环 中，APX以AsA为反应底物，将H2O2还原成H2O，从而减弱或消除H2O2的毒性，与此同时，AsA被氧化形成DHA，DHA在脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）的作用下，与GSH反应恢复成AsA，在这个过程当中，作为氢供体的GSH转变成氧化型谷胱甘肽（GSSG），后者又在GR的催化作用下，被还原为GSH［7］。AsA-GSH循环中各组分的协调运作，使植物体内积累的活性氧得到清除。

目前，有关谷子对除草剂胁迫生理响应的研究中，多以抗氧化保护酶系、膜透性、渗透调节物质等为研究对象［8］，而对AsA-GSH循环这一防御系统的研究鲜有报道。本试验以优质谷子品种晋谷21和抗拿捕净品种豫谷35、冀谷42为试验材料，研究了不同浓度拿捕净胁迫处理对谷子萌发、愈伤诱导、生长的影响，以及对AsA-GSH循环中关键酶APX、GR活性和抗氧化剂AsA、GSH等含量的影响，比较分析其在感抗性不同的谷子品种之间的差异，从细胞水平探究谷子对拿捕净胁迫的生理响应和抗性机制，为谷子抗除草剂相关研究和抗性品种选育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年在山西农业大学农学院植物组织培养室进行。晋谷21种子由山西省农科院经作所提供，豫谷35、冀谷42种子由山西农业大学谷子团队提供。拿捕净乳油有效成分为12.5%，由中华立农生产。

1.2 试验方法

1.2.1 诱导愈伤组织

以MS+2.0 mg·L-12，4-D+0.2 mg·L-16-BA作为愈伤组织诱导培养基，将灭菌后的谷子种子接种到添加不同浓度（0、0.5、1、2、3 mL·L-1）拿捕净的愈伤组织诱导培养基上，暗培养20 d，温度（25±1）℃。培养5 d时统计种子萌发率，20 d时统计愈伤组织诱导率，期间不断观察愈伤组织的生长情况。

1.2.2 测定生理指标

以不添加拿扑净的培养基培养2周后的愈伤组织作为拿捕净胁迫处理的材料。将诱导出的长势均匀一致的谷子愈伤组织分别接种到添加了不同浓度（0、0.5、1、2、3 mL·L-1）拿捕净的培养基中，在（25±1）℃下暗培养，2 d后取不同处理下的3个品种愈伤组织测定各项生理指标。生理指标：参照Nakano［9］的 方 法 测 定APX活 性，参 照Ma等［10］的方法测定GR活性；GSH含量的测定参照Ellman［11］的 方 法，AsA、AsA+DHA和DHA含量的测定参照Tanaka［12］等的方法。

1.2.3 数据的统计分析

采用Excel 2013软件进行数据统计与制图，用SPSS 19.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 拿捕净对谷子种子萌发的影响

由表1可见，随着拿捕净胁迫浓度升高，谷子种子萌发率总体呈下降趋势。与对照相比，抗性品种豫谷35和冀谷42种子萌发率下降幅度较敏感品种晋谷21小，可知高浓度拿捕净胁迫降低了3种谷子的萌发率，且对晋谷21的抑制明显大于豫谷35和冀谷42。比较豫谷35和冀谷42这2个抗性品种，在拿捕净浓度为0.5～1 mL·L-1时，冀谷42种子萌发率高于豫谷35，当拿捕净胁迫浓度升高后，二者种子萌发率的差异不明显。

表1 拿捕净对谷子种子萌发的影响Table 1 The effect of sethoxydim on germination of foxtail millet seeds

2.2 拿捕净对谷子种子愈伤组织诱导的影响

随着拿捕净胁迫浓度的升高，3种谷子愈伤组织诱导率均显著下降，但下降程度在品种间多有不同（表2）。与对照相比，抗性品种豫谷35和冀谷42愈伤组织诱导率下降幅度明显小于敏感品种晋谷21，豫谷35和冀谷42平均下降幅度差异不显著。此外，晋谷21愈伤组织褐化的速度也较豫谷35和冀谷42快，可见晋谷21愈伤组织的诱导率受拿捕净影响的程度显著大于豫谷35和冀谷42。

表2 拿捕净对谷子种子愈伤组织诱导的影响Table 2 The effect of sethoxydim on callus induction of foxtail millet seeds

2.3 拿捕净对谷子愈伤组织生长的影响

由图1可见，不同浓度拿捕净处理后，3个品种谷子愈伤组织的生长情况差异明显。当拿捕净浓度为0.5～1 mL·L-1时，3个谷子品种的愈伤组织受损害程度不大，可正常生长，但晋谷21愈伤组织出现轻微褐化（图1-c1）。当处理浓度提高至1～3 mL·L-1时，3个品种谷子愈伤组织均出现不同程度的褐化现象，晋谷21褐化死亡（图1 d1-e1），豫谷35愈伤组织生长逐渐受到抑制，处理浓度为3 mL·L-1时，愈伤组织明显褐化（图1 d2-e2），冀谷42愈伤组织在3 mL·L-1拿捕净胁迫后，愈伤组织才发生部分褐化（图1-e3）。可见，拿捕净对豫谷35和冀谷42愈伤组织生长的影响比对晋谷21小，这与其具有拿捕净抗性相一致。

2.4 拿捕净对愈伤组织细胞APX、GR活性影响

图1 不同浓度拿捕净对谷子种子愈伤组织诱导的影响Fig.1 Effects of different concentrations of sethoxydim on callus induction in foxtail millet seeds

由图2A可知，拿捕净胁迫处理后，参试谷子愈伤组织APX活性变化趋势不同。随拿捕净处理浓度的升高，抗性品种豫谷35的APX活性变化趋势为先升后降，在处理浓度为0.5 mL·L-1时达到峰值随后下降，冀谷42的APX活性呈波动趋势，但其总体活性高于晋谷21，敏感品种晋谷21愈伤组织APX活性持续上升，尤其在处理浓度大于2 mL·L-1后，APX活性显著大于豫谷35但小于冀谷42。在处理浓度为3 mL·L-1时，晋谷21和冀谷42的APX活性均达到最大值。

图2 不同浓度拿捕净处理下愈伤组织细胞抗氧化酶活性变化情况Fig.2 Changes of antioxidant enzyme activity in callus cells treated with different concentration of sethoxydim

由图2B可以看出，随着拿捕净处理浓度的升高，谷子愈伤组织中GR活性总体呈下降趋势。抗性品种豫谷35和冀谷42愈伤GR活性变化趋势均为先升高后降低，豫谷35的GR活性在处理浓度为0.5 mL·L-1时达到峰值，且显著高于其他2个品种，冀谷42的GR活性则在胁迫浓度为1 mL·L-1时达到峰值，敏感品种晋谷21愈伤组织GR活性持续降低。综合分析，拿捕净各浓度处理下，豫谷35和冀谷42的GR活性均显著高于晋谷21。

2.5 拿捕净对愈伤组织细胞抗坏血酸、还原型谷胱甘肽含量变化的影响

由图3A可见，拿捕净处理后，豫谷35愈伤组织AsA+DHA含量呈降低趋势，冀谷42愈伤组织AsA+DHA含量变化呈先降低后升高再降低再升高的波动趋势，在各浓度下2个抗性品种AsA+DHA含量始终高于晋谷21。晋谷21愈伤组织AsA+DHA含量变化趋势与冀谷42一致，在拿捕净浓度为3 mL·L-1时，二者含量均达到最大值。

由图3B可见，随着拿捕净浓度的升高，豫谷35愈伤组织AsA含量呈上升趋势，在拿捕净处理浓度为3 mL·L-1达到最高，冀谷42愈伤组织AsA含量呈持续下降趋势，二者的AsA含量始终高于晋谷21。晋谷21愈伤组织AsA含量变化趋势与冀谷42一致，但下降幅度显著大于冀谷42。

由图3C可见，拿捕净胁迫后，豫谷35愈伤组织DHA含量总体呈降低趋势，冀谷42中DHA含量变化呈先降低后升高再降低再升高的趋势，晋谷21愈伤组织DHA含量变化趋势与冀谷42一致，在拿捕净浓度为3 mL·L-1时，二者含量均达到最大值。在各浓度下，2个抗性品种中DHA含量始终高于敏感品种晋谷21。

由图3D可见，随着拿捕净浓度的升高，豫谷35和冀谷42愈伤组织GSH含量均呈先升后降的变化趋势，当拿捕净处理浓度为0.5 mL·L-1时豫谷35的GSH含量达到最高，处理浓度为2 mL·L-1时冀谷42的GSH含量达到最高，且豫谷35的峰值大于冀谷42，晋谷21愈伤组织GSH含量总体呈下降趋势。无拿捕净胁迫时晋谷21愈伤组织AsA含量高于其他2个抗性品种，在拿捕净胁迫下，豫谷35和冀谷42愈伤组织GSH含量普遍高于晋谷21。

2.6 拿捕净胁迫下3个品种谷子愈伤组织各项生理指标的相关分析

分析比较3个品种谷子愈伤组织在不同浓度拿捕净胁迫后所测定的各项生理生化指标之间的相关性可知，感抗性不同的3个品种各个指标间相关性均差异显著（表3～表5）。

图3 不同浓度拿捕净处理下愈伤组织细胞抗氧化剂含量变化情况Fig.3 Changes of antioxidant content in callus cells treated with different concentration of sethoxydim

晋 谷21中，AsA含 量 与DHA含 量 和APX活性呈极显著负相关关系，与GSH含量、GR活性呈正相关关系，GSH含量与GR活性呈显著正相关关系。豫谷35中AsA含量与其他指标均呈负相关关系，且与APX活性负相关程度较大，GSH含量与AsA之外的各项指标均呈正相关，且与APX活性为极显著相关，与GR活性为显著相关。冀谷42各指标间的相关关系与晋谷21相似，可推测在拿扑净胁迫下，这2个谷子品种AsA-GSH循环系统的防御机制一致。

3 讨论

与对照相比，随着拿捕净处理浓度的升高，敏感品种晋谷21的萌发率和愈伤诱导率下降幅度较抗性品种大，这与其不具抗性相一致。本研究也发现参试谷子品种发芽率差异较大，可能与品种种子自身发芽率高低有关，另一方面可能由于离体培养时消毒剂灭菌对种子活力造成一定影响。

APX和GR是循环中的2个关键抗氧化酶，适度的胁迫环境能够引起植物AsA-GSH循环中抗氧化酶活性的升高［13］。研究表明，APX是植物和藻类特有的清除过氧化氢（H2O2）的重要酶类［5］，APX对环境变化较敏感，通过氧化AsA来清除过量的H2O2。目前，关于盐胁迫下APX活性升高的报道较多［14，15］，在本研究中，随着拿扑净浓度的升高，晋谷21和冀谷42愈伤中APX活性与对照相比出现不同程度的升高，这与汪月霞［16］研究在一定浓度的Na2CO3胁迫下，芦荟幼苗可以通过提高APX等抗氧化酶的活性来降低细胞中活性氧的积累量，来增强植物体的耐盐碱性结果基本一致。而抗性品种的增幅均显著高于同期的敏感型品种，说明抗性品种通过维持较高APX活性抵御逆境。GR是植物在长期进化过程中形成的一套代谢毒性物质的解毒酶系统的重要组成部分之一，在降低正常细胞代谢和氧胁迫条件下脂质过氧化方面具有重要作用［17］。GR的主要功能是利用NADPH提供的还原H催化GSSG变成GSH，能够促进AsA和GSH的再生。其活性高低决定了AsA-GSH循环系统的运行速率。宫维嘉等［18］认为盐胁迫下，GR活性不能一直升高，是由于活性氧的产量超出了抗氧化系统的清除能力、并危及

了GR的活性，导致GR活性降低，从而使植物受到伤害，在本研究中也出现类似情况。

表3 晋谷21种子愈伤组织各项生理指标的相关分析Table 3 Correlation analysis of physiological indexes of seeds callus in Jingu 21

表4 豫谷35种子愈伤组织各项生理指标的相关分析Table 4 Correlation analysis of physiological indexes of seeds callus in Yugu 35

表5 冀谷42种子愈伤组织各项生理指标的相关分析Table5 Correlation analysis of physiological indexes of seeds callus in Jigu 42

AsA和GSH是AsA-GSH循 环途径 中2种重要的抗氧化物质，在清除植物体内活性氧方面具有重要作用，通常两者相协同起作用［19］。在此循环中APX以AsA为反应底物，将H2O2还原成H2O，同时AsA可被氧化成单脱氢抗坏血酸（MDHA）和脱氢抗坏血酸（DHA），在完全氧化的DHA产生的情况下，GSH作为还原剂参与AsA的再生，同时GSH可以被氧化，产生的氧化型谷胱甘肽（GSSG）可以通过GR还原成GSH。本研究发现，谷子愈伤中AsA含量与APX活性呈负相关，晋谷21和冀谷42中AsA含量随APX活性升高呈下降趋势，这可能是由于植物体通过提升APX活性以清除过量活性氧，而AsA作为应底物被大量消耗的缘故。豫谷35中AsA含量随APX活性降低呈上升趋势。Foyer和Noctor［20］认为，GR活性的高低直接决定了GSH库的水平，较高的GR活性对于植物体保持较高的GSH含量非常重要。高永生和陈集双［21］发现低浓度盐胁迫使小麦叶片AsA和GSH的含量有一定程度响应性升高，而高盐胁迫下两者的含量都呈现出了下降趋势。这与本研究结果基本一致。Shalata等［22］研究发现，盐胁迫使盐敏感番茄根系中的AsA含量降低，DHA含量明显升高，而耐盐品种则与之相反。本研究中敏感型品种晋谷21，在拿扑净胁迫下，愈伤中AsA含量降低的同时DHA含量明显升高，抗性品种豫谷35则与之相反。

4 结论

拿捕净胁迫对谷子种子的萌发、愈伤组织的诱导以及愈伤组织的生长产生明显的抑制作用，且对晋谷21谷子的影响要明显大于抗性品种豫谷35和冀谷42，萌发抑制率为晋谷21（58.86%）＞冀谷42（54.29%）＞豫谷35（33.15%），愈伤诱导抑制率为晋谷21（45.14%）＞冀谷42（41.71%）＞豫谷35（27.43%）。不同浓度拿捕净胁迫处理后，抗性品种豫谷35和冀谷42各项指标的变化幅度与感性品种晋谷21差异显著。