利用SRAP分子标记研究山西省野生山丹的遗传多样性

王晶，李建，史根生，郝华正，冀中锐，邢国明

（1.山西农业大学 经济作物研究所，山西 汾阳，032200；2.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷，030801）

山丹（Lilium pumilumDC.），又名细叶百合，为百合科百合属多年生草本植物。山丹花色鲜艳，株型秀丽，具有较高观赏价值。同时，野生山丹具有较强的茎腐病和叶枯病抗性，是我国百合育种和品种改良的重要基因资源。

以DNA多态性为基础的分子标记技术在植物 遗 传 多 样 性 研 究［1～5］、品 种 鉴 定［6～8］、系 统 分类［9～12］、农艺性状定位［13～17］等方面具有广泛应用。关于利用分子标记研究山丹遗传多样性的报道较少，Yamagishi［18］用ARPD标 记 对百 合 属 植 物 进 行了种间鉴定；刘冬云［19］通过SSR标记对北京等13个省市及河北多地山丹进行了种质资源差异研究；李晶［20］利用ISSR标记对北京、河北、辽宁、内蒙等北方地区的山丹和百合进行了遗传多样性研究；郝凯凯［21］利用ISSR标记探索了延安地区野生山丹种质的遗传多样性。然而，关于山西省境内山丹种质遗传多样性的研究少见报道。本研究利用24组SRAP分子标记对山西省境内13个地区的16份山丹种质进行了基因型鉴定与遗传多样性分析，旨在探索山西省境内山丹种质的遗传多样性，为山丹种质资源鉴定与保护、育种应用和分子机理研究提供理论基础和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

在山西省13个植被资源丰富的地区采集了16份山丹种质作为供试材料，采集地点分别是芮城县百梯山、沁水县历山、陵川县王莽岭、陵川县黄围山、太谷县窑子头、交城县庞泉沟、宁武县芦芽山、五台县五台山、平鲁县大草坪和大同市七峰山、大同市采凉山、天镇县林场、浑源县恒山地区。各采集点地理信息见表1，16份山丹供试样品的植物学特征见表2。

表1 样品采集地区地理信息Table 1 Geographic information of sample collection areas

表2 供试样品的植物学特征Table 2 Botanical characteristics of samples

1.2 试验方法

山丹基因组总DNA提取采用改良的CTAB法，提取后DNA通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行质检，并溶于1×TE缓冲液保存于−20℃备用。PCR反应体系为20μL，其中10×PCR buffer 5μL（含Mg2+）、2.5 mmol·L-1dNTPs 2μL、5 U·μL-1Taq酶0.3μL、50 ng·μL-1引物各2μL、30 ng·μL-1DNA 1μL、ddH2O 9.7μL。PCR反应程序为：①94℃预变性5 min；②94℃变性1 min，35℃退火1 min，72℃延伸80 s（5个循环）；③72℃延伸10 min；④94℃变性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸80 s（37个循环）；⑤72℃延伸12 min。扩增产物采用6%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，银染后拍照保存。PCR buffer、dNTPs、Taq酶均购买 于江苏康为世纪生物科技有限公司，试验引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表3。

表3 SRAP引物序列Table 3 SRAP primer sequences

统计扩增产物检测带型得到供试样品的基因型数据，利用NTSYSpc-2.0软件，计算出16份山丹种质的相似系数矩阵。SRAP分子标记为显性标记，因此将基因型的有无转化为数字1和0，形成每个样本的数字指纹图谱，便于统计与分析。

2 结果与分析

2.1 DNA提 取与PCR产物 检测

通过改良的CTAB法提取的山丹基因组总DNA带型清晰，无明显拖尾，DNA完整性好，可用于后续基因型检测实验（图1a）。在88对SRAP引物组合中，有24对组合可以扩增出清晰的特异性条带（表4，图1b）。

2.2 供试样品的多态性分析及指纹图谱构建

经统计，24对引物组合共扩增出821条条带，每对引物可扩增出21～52条清晰条带，多态性条带17～47条，多态性比率为70%～90.4%，鉴别能力在31.25%～100%。平均每对引物扩增出34.2个条带。其中，引物组合Me-7/Em-5的多态性较好，可区分全部16份山丹样品。24对引物组合所扩增的条带数及多态性条带数、比率和鉴别能力见表4。

根据统计结果，将引物组Me-7/Em-5基因型的有无转化为数字1和0，形成每个样本的数字指纹图谱，便于结果保存与计算机识别分析（表5）。

表5 引物组Me-7/Em-5在16份山丹种质中的指纹图谱Table 5 Fingerprinting of sixteen Lilium pumilum germplasms amplified by Me-7/Em-5 primer pairs

续表

2.3 遗传多样性分析

利用NTSYS2pc2.0软件，采用UPGMA方法进行聚类分析，构建出遗传距离关系树状图。16份山丹种质的Jaccardp’s相似系数在0.58～0.83之间，在相似系数为0.61的水平上，可以将供试样品分为两大类群。第一类群共13份样品，包含

图1 DNA质检和PCR产物凝胶电泳Fig.1 Quality control of DNA and the gel electrophoresis of PCR products

图2 样品聚类与样品采集点Fig.2 Clustering result and the sample collection areas

No.01、No.03、No.05、No.07、No.08、No.09、No.10、No.11、No.12、No.13、No.14、No.15、No.16样品，第二类群共3个样品，包含No.02、No.04、No.06（图2a）。

在第一类群中，13个供试样品又可细分为4个小类群。第一小类群为位于山西北部的大同市采凉山、浑源县恒山、大同市矿区和天镇县林场的4份山丹样品；第二小类群为位于山西中北部的五台县五台山、平鲁县打草坪、宁武县芦芽山和交城县庞泉沟的4份样品；第三小类群为位于山西南部的陵川县王莽岭、黄围山、沁水县历山和芮城县百梯山的5份山丹样品；第四小类群为太谷县窑子头的1份山丹样品（图2b）。

3 讨论与结论

山丹具有丰富的遗传变异和较强的抗病、抗逆能力，是我国百合育种和品种改良的重要基因资源。建立有效的分子标记，对加快山丹种质资源遗传分析和百合育种具有重要的理论意义。分子标记具有检测效率高、不受环境影响等优势，正在成为植物品种鉴定与保护、品种选育、分子机理研 究 的 强 有 力 工 具［22～24］。本 研 究 通 过 对88组SRAP引物进行筛选，得到24组多态性丰富的引物组合，24组引物可分别扩增出21～52条清晰条带，多态性条带17～47条，多态比率为70%～90.4%，鉴别能力31.25%～100%。本研究结果表明，SRAP分子标记可以有效地鉴别山丹种质遗传多样性，该24对引物组合为山西省境内山丹品种保护与鉴定、育种应用提供了可靠的标记基础。

研究通过24组SRAP分子标记将16份山丹种质分为两大类群，一类群共13份样品，花色均为橘色，另一类群共3份样品，花色均为红色。由此表明，山西省境内不同花色间的山丹种质遗传差异性更大。红色花株型较大，根茎叶和花都明显比橘色花种质的大。橘色花类群山丹种质较为丰富，又可分为4个亚群。采凉山、恒山、天镇等地均为沙地，生境较差，山丹种质的遗传相似度较高。同样，生长于腐叶土环境的山丹种质遗传相似度也较高，且2种生境的山丹种质有较高的遗传差异性。北部生态环境脆弱地区的种质在性状上与其他种质差别很大，不仅发生了小型化的变化，而且茎叶花薄，部分花发生不规则反卷，可见生境差异也是影响山丹种质遗传多样性的重要因素，同时也反映出种质的抗逆性较强，具有较高的优良基因开发潜力。由此可以看出，同一花色内山丹种质遗传差异性与山丹种质的地理分布和生境条件紧密相关，同一生境条件下的山丹种质遗传相似度更高。刘冬云［19］对北京等13个省市的山丹种质的遗传差异分析发现，不同地区不同生境的山丹种质抗尖孢镰刀菌能力、耐极端气候能力均有较大差异，从表型到分子水平均表现出较高的遗传差异性。山丹丰富的遗传变异和较强的抗病、抗逆能力，都使其成为我国百合育种的宝贵资源；郝凯凯［21］对延安野生山丹种质遗传多样性的研究发现海拔高度、年日照时数、年降水量、气温等地理、气候因子均对山丹种质遗传多样性产生影响。综上，山丹种质具有丰富的遗传多样性，是宝贵的遗传改良资源。

表4 SRAP引物扩增产物多态性信息统计Table 4 Polymorphism statistics of PCR products amplified from 24 pairs of SRAP primers

山丹是我国百合育种和品种改良的重要基因资源，建立成熟的分子标记体系可促进山西省境内山丹种质的高效利用。本研究表明，SRAP分子标记可以有效地鉴别山丹种质遗传多样性，山西省境内不同花色间的山丹种质遗传差异性更大，同一花色内的山丹种质遗传相似度与地理分布、生境条件紧密相关。本研究为山丹种质的保护与鉴别、育种应用和分子机理研究提供了技术支撑和理论基础。