11类菌种固态发酵对青蒿叶渣功效成分的影响

丁嘉伟，苏新堯，马婷玉，王晚晴，向丽，冯宝民*，王彩霞*

（1.大连大学 生命科学与技术学院，辽宁 大连116622；2.中国中医科学院中药研究所，北京100700；3.北京联合大学 生物化学工程学院，北京100023）

随着中药行业快速发展，中药加工企业数量不断增加，加工生产过程中产生大量中药渣，传统处理方法有焚烧、填埋、固定区域堆放等，处理药渣不仅需要投入大量资金，也造成中药资源大量浪费［1］。

黄花蒿，别称青蒿（Artemisia annua），是我国传统中药，主要用于消肿、止汗、凉血等［2］。青蒿中除含有抗疟成分青蒿素、青蒿酯钠、蒿甲醚外，还含有青蒿酸、双氢青蒿素、青蒿醇、青蒿乙素等功效成分。青蒿素等功效成分药理作用的深入研究，促使相关青蒿原料制药企业加大青蒿素等功效成分的提取，青蒿药渣量逐渐增加，残留功效成分和药用价值得不到充分利用。因此积极探索青蒿叶渣新的应用，增加青蒿产品种类及附加值［3］，有助于提升青蒿叶渣资源利用率。

目前中药渣处理方式有重新提取药渣中有效成分、制成无公害化肥、作为食用菌栽培基质及饲料添加剂等。张顺喜等人［4］针对中药渣难处理的问题，以污水处理厂厌氧污泥为接种物，发酵中药渣产生沼气，为中药渣的综合利用提供新思路。动物养殖方面，通过优化菌种及配比方式，将中药渣发酵生产功能性饲料，可以提高泌乳獭兔的生产性能［5］及断奶仔猪的免疫力［6］。研究发现，中药渣中含有丰富的粗脂肪、粗蛋白、多糖和多种微量元素，是一种可循环的生物质资源和天然培养基。微生物分泌纤维素酶、蛋白酶及多种微量元素，可破坏植物细胞壁，大幅度提升发酵产物中功效成分含量。

综上所述，本研究采用固态发酵的方式，探索开发青蒿叶渣作为动物保健产品的可能性，为青蒿叶渣综合处理提供新思路，具有广阔的市场发展前景。

1 试验材料

1.1 试验菌种

试验菌株见表1。

1.2 仪器

恒温振荡器THZ-98A；紫外分光光度计UV-5100B；GCMS-QP20（日本岛津）；微量XPE/微量分析天平；漩涡震荡器Vortex-1；真空浓缩机CONCENTRATOR PLUS（德国艾本德公司）；洁净工作台SW-CJ-2FD；无氧发酵袋（28 cm×40 cm）。

1.3 试剂

氢氧化钠、硫酸铜、酒石酸钾钠、石油醚均购买自北京化工厂；青蒿乙素、双氢青蒿酸标品购自成都埃法生物科技有限公司；青蒿叶渣由广西仙草堂有限责任公司提供。

2 方法

2.1 种子液制备

里氏木霉、地衣芽孢杆菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、丁酸梭菌、植物乳杆菌B7、酵母菌和毕赤酵母菌按接种量2%接种于30 mL LB（1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1%氯化钠）培养基并连续活化2次，取第二次活化菌液，再次按接种量2%接种于100 mL LB培养基，酵母菌和毕赤酵母菌30℃培养24 h，其余菌株37℃培养24 h，丁酸梭菌种子液培养在厌氧发酵瓶中进行。

2.2 发酵

青蒿叶渣固体培养基成分：30 g青蒿叶渣、5 g玉米浆、20 g豆粕、3 g红糖、2 g石粉，以上5种物质混合粉碎过80目筛，每组重复3次。

单一菌株发酵：里氏木霉、地衣芽孢杆菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌B7、丁酸梭菌、酵母菌和毕赤酵母菌单一菌种种子液40 mL接种于固体培养基中，酵母菌和毕赤酵母菌30℃发酵7 d，其余菌株37℃培养7 d，丁酸梭菌在无氧发酵袋中发酵，每组重复3次。

优选菌混合发酵：根据粗蛋白、双氢青蒿酸和青蒿乙素试验结果，选取枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌和酵母菌作为进一步试验对象，各取13 mL种子液混合加入固体培养基中，37℃培养7 d，混合菌固态发酵，每组重复3次。

2.3 粗蛋白和功效成分测定方法

青蒿叶渣固态发酵产物处理采用余正文对青蒿的处理方法［10］；发酵产物粗蛋白含量测定采用双缩脲法［11］；发酵产物功效成分检测使用GC-MS测定，采用Tian的检测方法［12］。

2.4 饲喂实验

选取日龄132天、4 800羽的罗曼灰鸡，平均分为3组，每组重复3次。对照组饲喂全价料，试验组青蒿叶渣混合菌发酵产物按5%比例添加到全价料中饲喂鸡群，15 d后观察并比较2组鸡蛋色泽及粪便颜色，并进行筛粪处理。

表1 试验菌种及其特性Table 1 Bacterial strains and their characteristics used in the study

2.5 统计学分析

采用GraphPad Prism 7软件进行统计分析，数据采用x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间进一步比较采用LSD-test，P＜0.05差异有统计学意义。

3 结果与分析

3.1 菌株生长曲线结果

如图1所示，微生物固态发酵生长曲线整体呈增长-平稳-下降趋势。菌株生长对数期主要集中在72～96 h。随着培养时间延长，培养基中营养成分含量减少，不能满足菌株生长发育的需要，菌株数量不断减少，生长曲线逐渐降低。发酵菌株中混合菌，在72 h菌株数量达到峰值，生长情况最好。干酪乳杆菌在120～144 h达到对数期，干酪乳杆菌较其他菌株生长对数期时间延后。

3.2 粗蛋白含量结果

蛋白质是动物新陈代谢、生长发育等生理活动必不可少的营养物质，是动物重要的营养源之一，对体组织、器官和细胞的形成、修补、增生以及酶类和激素功能的实现都是不可或缺的，其作用是其他营养物质不可替代的［13］。

酪蛋白标准曲线Y=0.102 3x−0.000 2，R2=0.999 5。如图2所示，青蒿叶渣发酵后积累粗蛋白含量整体呈上升趋势，青蒿叶渣发酵后与对照组比较，酵母菌发酵青蒿叶渣积累粗蛋白含量提高了71.15%（P＜0.05），提高程度最高，这可能与酵母菌含有丰富的蛋白质、维生素和氨基酸等有关；其次是植物乳杆菌B7，发酵后其粗蛋白含量提高了58.59%（P＜0.05）；瑞士乳杆菌发酵后其粗蛋白含量提高了55.45%（P＜0.05）。综上，酿酒酵母菌适合应用于发酵提高相关产品粗蛋白。

3.3 青蒿叶渣功效成分含量结果

双氢青蒿酸和青蒿乙素标准品通过GC-MS检测得到色谱图和质谱图，通过对2种功效成分定量分析，比较发酵后双氢青蒿酸和青蒿乙素功效成分含量变化。

由图3可见，青蒿叶渣经过固态发酵，双氢青蒿酸和青蒿乙素含量显著提高，整体呈上升趋势。数据显示，青蒿叶渣经地衣芽孢杆菌发酵后与对照组比较，双氢青蒿酸和青蒿乙素含量分别提高了111.74%（P＜0.05）和71.15%（P＜0.05）；其次是瑞士乳杆菌，发酵后其双氢青蒿酸含量提高了101.93%（P＜0.05）；青蒿叶渣经丁酸梭菌发酵后，其青蒿乙素含量提高了82.67%（P＜0.05）。

图1 青蒿叶渣固态发酵菌株生长曲线Fig.1 Growth curves of solid fermentation strains of Artemisia annua leaf residue

3.4 混合菌发酵

根据上述单一菌种固态发酵青蒿叶渣后粗蛋白、双氢青蒿酸、青蒿乙素含量变化结果，选择酵母菌、植物乳杆菌及枯草芽孢杆菌组成混合菌，发酵青蒿叶渣。如图4、图5所示，青蒿叶渣经混合菌固态发酵后，粗蛋白含量提高了61.73%（P＜0.05），双氢青蒿酸含量提高了82.76%（P＜0.05），青蒿乙素含量提高了69.15%（P＜0.05）。混合菌固态发酵青蒿叶渣功效成分含量提升显著，为探索青蒿叶渣作为动物饲料添加剂的开发产提供理论指导。

图2 青蒿叶渣固态发酵后粗蛋白含量Fig.2 Crude protein content of Artemisia annua leaf residue after solid-state fermentation

图3 青蒿叶渣固态发酵后青蒿乙素、双氢青蒿酸含量Fig.3 The content of artemisinin and dihydroartemisinic acid after solid-state fermentation of Artemisia annua leaf residue

3.5 饲喂试验结果分析

图4 混合菌固态发酵青蒿叶渣后粗蛋白含量Fig.4 Crude protein content after solid-state fermentation of Artemisia annua leaf residue by mixed bac

图5 混合菌固态发酵青蒿叶渣后双氢青蒿酸、青蒿乙素含量Fig.5 The content of dihydroartemisinic acid and artemisinin after solid-state fermentation of Artemisia annua leaf residue by mixed bacteria

如图6所示，青蒿叶渣混合菌发酵产物作为饲料添加剂饲喂罗曼灰鸡群后，蛋壳的光泽度改善，亮度增加，颜色和蛋壳质量改善不明显（图6A），红粪情况明显好转，粪便成型，变细腻，罗曼灰鸡的肠毒过料效果明显（图6B）。

图6 青蒿叶渣混合菌固态发酵后鸡蛋、粪便变化Fig.6 Changes of eggs and feces after solid fermentation of Artemisia annua leaf residue mixed bacteria

4 讨论

中药渣掩埋堆放不仅造成中药资源浪费，增加相关制药企业支出［14］，开发中药渣综合利用新技术，提升中药渣利用率。本研究选取里氏木霉、地衣芽孢杆菌、黑曲霉菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、丁酸梭菌、植物乳杆菌B7、酵母菌、毕赤酵母菌及复合菌株（酿酒酵母菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌）固态发酵青蒿叶渣，探索其作为动物饲料添加剂的可能。粗蛋白含量是饲料添加剂的一个重要评价标准，本研究结果显示酵母菌固态发酵粗蛋白含量提高71.15%（P＜0.05），提高最大，适合用于发酵生产。

王梅等研究益生菌剂采用固态发酵模式发酵国产豆粕，以发酵产品中粗蛋白与可溶性蛋白为指标，与空白对照组比较，其中C（乳酸菌、酿酒酵母、母、中性蛋白酶）组粗蛋白含量提高47.11%，提升最高［15］。青蒿叶渣中未充分提取的功效成分含量影响着相关动物保健产品的探索开发，青蒿药渣经地衣芽孢杆菌固态发酵双氢青蒿酸和青蒿乙素分别提高了111.74%（P＜0.05）和71.15%（P＜0.05），功效成分提高最高，推测是地衣芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，可对青蒿叶渣细胞壁降解，促进功效成分释放。但是地衣芽孢杆菌具有独特的生物夺氧机制，不能和其他好氧微生物进行混合发酵。综合来看，酿酒酵母菌对蛋白提升最为显著，在功效成分释放上，枯草芽孢杆菌及植物乳杆菌提升显著，也是常用益生菌，因此选择酿酒酵母菌、植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌作为混合菌种进行发酵生产进行后续饲喂实验。

发酵青蒿渣产品的蛋鸡饲喂实验结果显示蛋壳亮度增加，鸡群红粪情况明显好转，粪便变得细腻，过料残渣明显减少，推测与双氢青蒿酸和青蒿乙素对鸡肠道球虫有明显抑制作用，且益生菌分泌大量抑菌物质，改善禽畜肠道内环境有关。李姣清研究在鸡的日料中按1 g·kg-1体重添加中药复方制剂到半天的饮水中，结果发现中药复方制剂对小肠形态结构有积极影响，可以增加肠道菌群多样性，有效地改善肠道健康和功能，促进雏鸡的生长［16］。周翠珍等用常山、青蒿、苦参、柴胡、地榆（炭）、白头翁等组成的纯中药散剂，按照0.25%、0.5%、l%浓度给不同试验组鸡混匀拌料饲喂，试验结果表明，l%纯中药散剂组0.5%纯中药散剂组的抗球虫指数在160～180之间，为中效，2个剂量均能很好的控制人工感染柔嫩艾美耳球虫病鸡免于死亡，改善禽畜过料病症，保护肠道健康［17］。所以青蒿叶渣采用微生物固态发酵模式，粗蛋白含量提高，残留功效成分得到充分释放，未来可作为动物养殖饲料添加剂。

5 结论

本研究通过微生物固态发酵青蒿叶渣，发酵后粗蛋白、双氢青蒿酸、青蒿乙素含量均较对照组有所提高。青蒿叶渣经酿酒酵母菌发酵后产物中粗蛋白含量最高，经地衣芽孢杆菌发酵后产物中双氢青蒿酸、青蒿乙素含量最高。混合菌固态发酵青蒿叶渣使产物中功效成分含量得到较高提升，将其添加到动物饲料中饲喂鸡群，红粪情况明显好转，尚不能明确益生菌和青蒿功效成分对鸡肠道保健的作用机制。如将青蒿添加到动物饲料目录中，可使该研究结果为今后进一步探索工厂化发酵生产青蒿动物饲料添加剂提供参考依据。