绵羊MC1R和Agouti基因多态性与毛色性状的关联分析

薛丽娜，罗惠娣，周胜花，毛杨毅

（山西农业大学 动物科学学院，山西 太谷030801）

绵羊除了产肉外，产毛也是其主要的经济性状。毛色决定着羊毛的价格，也是品种的标志，在绵羊选育中毛色的选择具有重要意义。动物毛色是由毛囊中的黑色素决定，黑色素包括真黑素和褐黑素，真黑素使毛色表现为黑色或褐色，而褐黑素则使毛色表现为黄色或红色，二者按不同比例存在于毛囊中使毛色呈现出由深至浅、丰富多彩的颜色，黑素皮质受体1基因（MC1R基因）和鼠灰色基因（Agouti基因）可调控这2种色素相对含量。包括绵羊在内的大多数物种的MC1R基因只有一个外显子，其编码的蛋白具有7个跨膜功能域［1］。Agouti基因由4个外显子和3个内含子组成，其中2、3、4外显子编码ASIP分泌信号蛋白。MC1R基因与对抗炎症相关，而Agouti基因与肥胖、糖尿病和肿瘤易感性等具有一定关系，但二者最主要的作用是调控色素合成［1，2］。在黑色素细胞膜上，MC1R蛋白与胞外促黑色素细胞激素（α-MSH）结合，促进真黑素的合成，而ASIP分泌蛋白，通过竞争性结合MC1R受体合成更多的褐黑素［3］。关于MC1R和Agouti基因影响动物被毛表型的研究较多，包 括 水 牛［4］、水 貂［5］、狐 狸［6］、马［7］和 豚 鼠［8］等。关于绵羊的研究中［9］，MC1R和Agouti基因的单核苷酸位点突变均与毛色相关，同时这2个基因多数情况下会显示上位互作效应。

绵羊的毛色是一个重要的生产性状，有白色、黑色、褐色和斑块状杂色［10］。白色羊毛中不含或含少量褐黑素，褐色和黑色羊毛则含有黑色素或两种色素的混合，完全黑色的绵羊较为少见。山西地方绵羊一般为白色，我们前期研究发现，以黑头杜泊（公）与本地白色绵羊（母）杂交产生的白色羊（全身白色脸部黑色斑块）为母本，以萨福克为父本，杂交产生的后代中部分是黑色被毛绵羊。因此，本试验以黑色被毛绵羊和其母本白色羊（图1）为研究对象，分析该群体中绵羊MC1R和Agouti基因CDS区的SNPs和单倍型与毛色的关系，探索控制毛色的主效基因，为绵羊毛色分子标记辅助育种提供依据。

图1 2种被毛颜色的试验绵羊Fig.1 Experimental sheep with two coat colors

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验样本来自山西省广灵县同羊农牧有限公司羊场，随机选取上述杂交模式下产生的全黑色被毛绵羊及和其母本白羊各30只，采集各羊的颈静脉血样5 mL于抗凝管中，−20℃冻存，用于DNA提取试验。

1.2 试验方法

1.2.1 血液基因组提取和引物设计

参照血液基因组DNA提取试剂盒指南（天根DP348）提取DNA。利用核酸蛋白测定仪和1%琼脂糖凝胶对提取的DNA质量进行检测。根据NCBI查找绵羊MC1R和Agouti基因的mRNA序列，GenBank登 录 号 分 别 为NM_001282528.1和NM001134303。利用Primer5.0软件设计引物，并扩增上述2个基因的编码区，引物MC1R用以扩增MC1R基因唯一外显子区域，引物Agouti-2、Agouti-3及Agouti-4扩增Agouti基因2、3、4外显子区域，引物由上海生物工程有限公司合成，合成引物如表1所示。

1.2.2 目的片段扩增

以提取的DNA为模板，根据2×Taq PCR MasterMix的说明，建立50μL的反应体系：上下游引物（10μmol·μL-1）各1μL，2×MasterMix 25μL，DNA和RNase Free dH2O共23μL（其 中 含100 ng的DNA）。反 应 条 件：94℃5 min（预 变性阶段）；94℃30 s，退火温度（表1）30 s，72℃30 s，共35个循环（PCR反应阶段）；72℃5 min。采用电泳检测扩增PCR产物，随后送上海吉美生物公司对扩增产物纯化后双向测序。

1.3 统计分析

测序结果用Chromas软件查看峰图，分别用SeqVerter软件和ClustalX2.1软件对序列合并及比对。统计突变位点的个数，计算基因型频率和等位基因频率，运用SPSS18.0中的χ2独立性检验分析突变位点是否与毛色表型相关。用SHEsis在线软件对突变位点连锁不平衡和单倍型分析。

2 结果与分析

2.1 DNA质量检测

样本DNA的浓度检测结果显示，其浓度均在30～100 ng·μL-1范围内，OD260/OD280值均在1.8～1.9之间。提取产物经电泳检测（图2），DNA为一条较整齐的条带，亮度较好，没有降解，说明提取DNA浓度和纯度较高，可以进行后续试验。

2.2 PCR扩增产物检测

绵羊MC1R基因外显子和Agouti基因2、3、4外显子扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，4个扩增产物均为特异性产物，片段长度与预期长度一致。

表1 PCR扩增的引物信息Table1 Primer information of PCR amplification

M：DNA maker DL2000；1～12为：部分基因组DNA M：DNA maker DL2000；1−12：partial genomic DNA

图3 4个PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Fig.3 Agarose gel electrophoretogram of four PCR

2.3 MC1R和Agouti基因突变位点分析

60只绵羊MC1R和Agouti基因编码区的PCR产物送上海美吉公司纯化后测序，分别用SeqVerter软件和ClustalX2.1软件对序列合并及比对发现，Agouti基因2、3外显子无SNPs突变位点，外显子4有2个SNPs突变位点，其中g.5051G＞C为同义突变，g.5172T＞A（P.C126S）为错义突变，导致氨基酸序列中126处由半胱氨酸变为丝氨酸。MC1R基因编码区有5个突变位点，其中3个突变位点（c.429C＞T、c.600T＞G和c.735 C＞T）为同义突变，c.218T＞A（P.M73K）为错义突变，导致氨基酸序列中73处由甲硫氨酸变为赖氨酸，c.361G＞A（P.D121N）为错义突变，导致氨基酸序列中121处由天冬氨酸变为天冬酰胺，各突变在基因组中的位置如图4所示。

2.4 基因频率和基因型频率在黑色和白色绵羊群体中的分布

统计MC1R和Agouti基因各突变位点的基因型频率和等位基因频率，结果如表2所示。MC1R基因有3个位点优势等位基因频率大于0.8，c.218T＞A优势等位基因为T，c.361G＞A优势等位基因为G，c.429C＞T优势等位基因为C。Agouti基因g.5172T＞A位点优势等位基因为T。利用Hardy-Weinberg定律检验在黑色和白色毛色群体中的基因平衡状态，7个突变位点经χ2检验结果显示，Agouti基因2个突变位点及MC1R基因2个错义突变位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05），说明这4个位点的突变与毛色性状无相关性。MC1R基因3个同义突变位点均为P＜0.05，处于Hardy-Weinberg不平衡状态，说明MC1R基因中的这3个突变位点与毛色性状具有相关性。

表2 不同毛色绵羊MC1R和Agouti基因突变位点的基因型频率和等位基因Table2 Genotype and allele frequencies of MC1R and Agouti gene mutations in sheep with different coat color

2.5 基因连锁不平衡分析与单倍型构建

关联研究中，MAF太低会导致结果假阴性，一般选择等位基因频率大于0.05的SNPs来构建单倍型［9］。在本试验中，Agouti基因2个突变位点中的g.5172T＞A突变位点MAF小于0.05，因此Agouti基因不能用来构建单倍型。SHEsis在线软件可对样本中的突变位点配对连锁不平衡分析和基因单倍型构建，对MC1R基因中5个突变位点的连锁不平衡Lewontin系数进行分析，结果如图5所示。本试验中的D′均大于0.7，说明MC1R基因5个SNP位点之间连锁。进一步对5个SNP位点进行单倍型构建，在该群体中发现8种单倍型，如果5个SNP位点没有连锁，应该有25种单倍型，说明它们高度连锁，由于群体中单倍型的频率不能小于0.03［11］，因此，过滤掉单倍型小于0.03的数据后只有4种单倍型组合被分析（表3），经分析发现，TGTGT单倍型频率在黑色组中显著低于白色组（p＜0.01），而TGCTT单倍型频率在黑色组中的频率显著高于白色组（p＜0.05），初步推测这2种单倍型与毛色表型相关。

图5 MC1R基因单倍型连锁图Fig.5 Haplotype linkage map of MC1R gene

表3 不同毛色绵羊MC1R基因突变位点单倍型分布情况Table 3 Haplotypes distribution of MC1R mutations in sheep with different coat color

3 讨论

绵羊的MC1R基因是由Extension基因座编码，包括等位基因ED和E＋，其中ED为显性黑色等位基因，由于c.218T＞A（p.M37K）和c.361G＞A（p.D121N）位点突变引起，二者共同和单独存在，均可激活MC1R受体，使绵羊表现为黑色或棕褐色被毛，E＋为野生型不发生突变［9］。本试验在黑色和白色绵羊中均发现MC1R基因编码区有5个突变位点，其中3个突变位点（c.429C＞T、c.600T＞G和c.735 C＞T）为同义突变，2个错义突变c.218T＞A和c.361G＞A，关联分析发现这两个错义突变均与被毛表型不相关。李洪涛等［12］和何军敏等［13］对哈萨克羊的研究均表明，MC1R基因的c.218T＞A杂合突变与黑色毛色表型极相关，且在白色和棕色被毛羊中不存在该位点的突变。本试验在黑色和白色绵羊中均存在c.218T＞A突变位点且与毛色性状不相关，这与哈萨克羊的结果不同。於建国等［14］和Yang等［15］研究均表明，吐鲁番黑山羊和岷县黑裘皮绵羊中MC1R基因均存在3个同义突变位点和2个错义突变位点，且单倍型AATGT与黑色被毛表型相关，在本试验中未发现有AATGT单倍型。付冬丽［16］对10个中国地方绵羊品种MC1R基因5个突变位点单倍型分析发现可以构成3个单倍型：TGCTC、TGTGT和AATGT，且单倍型TGTGT多存在于头部黑色身体白色的藏羊中，本试验发现，TGTGT单倍型与头部黑色斑点身体白色的白羊毛色极相关，这与藏羊的研究结果一致。在与毛色相关的单倍型TGTGT和TGCTT中，突变位点均为同义突变。大量文献表明［17，18］，同义突变虽然不会改变蛋白质序列，但在特定环境下，同义突变能改变蛋白质结构和功能从而影响蛋白质的生物合成。本研究中与毛色相关的同义突变是否通过这样的机制调控毛色还需更进一步验证。

绵 羊Agouti是 一 个复 等 位 基 因［19］。AWt等位基因为显性白等位基因，由Agouti基因的190 kb基因组区存在多个拷贝而使其受到临近的多个ITCH启动子调控，导致绵羊毛色呈现白色或棕褐色等浅色被毛。Aa等位基因为非经典Agouti隐性黑毛突变位点，由第2外显子5 bp缺失（C.100-105 del AGGAA；D5）、9 bp的缺失（C.10-18 del AGCCGCCTC；D9）或 第4外 显 子 错 义 突 变（g.5172T＞A）使绵羊呈现全黑色或棕色被毛。本试验2种不同毛色群体中，Agouti基因外显子4上存在2个SNPs突变位点，其中g.5051G＞C为同义突变，g.5172T＞A为错义突变，且2个位点均与毛色表型不相关，这与阿勒泰羊和藏羊中的研究结果一致［20，21］。Gratten等［22］发现野生索艾绵羊的Agouti基因D5和g.5172T＞A突变与黑色被毛表型相关。孟浩浩等［20，23］研究发现，新疆细毛羊和中国美利奴（军垦型）羊Agouti基因D5缺失与黑色被毛毛色极显著相关。本试验群体中未发现有D5突变。在美利奴羊和玛萨斯羊中，多数黑色羊含有单拷贝的Agouti基因，而几乎所有的白色羊含有 多 个 拷 贝 的 该 基 因［24，25］。本 试 验 绵 羊 群 体 中Agouti基因拷贝变异是否与毛色相关有待进一步研究。

4 结论

Agouti基因外显子的单核苷酸突变多态性与其被毛不相关，MC1R基因3个同义突变位点和2个单倍型与毛色性状相关。