葡萄砧木实生苗的抗寒性评价

牛铁荃，郭雯岩，李雪雪，王晓芳，Gary Gao，纪薇，*

（1.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷030801；2.美国俄亥俄州立大学，哥伦布，OH43210）

中国葡萄种质资源丰富，种类繁多，地理分布广泛，其中蕴藏着大量的抗逆性优异种质［1，2］。我国大部分优质葡萄产区集中在北方地区，北方寒区的冬季极端低温是限制葡萄栽培的重要环境因素之一［3，4］，且其发生频率和破坏程度日益严重，严重影响种植效益［5］。随着葡萄产业的发展，葡萄嫁接栽培的应用越来越普遍，采用优良抗寒砧木嫁接栽培，能提高葡萄的抗寒越冬能力，进而影响其产量和品质［6～8］。因此，选择抗寒性砧木是寒区葡萄生产的一项关键工作。

近年来，葡萄抗寒性的鉴定与评价已有很多研究。范宗民等［9］利用主成分分析结合半致死温度，对不同砧木的‘赤霞珠’葡萄枝条的耐寒性进行综合评价，最终得出‘赤霞珠/5BB’嫁接植株的抗寒性最高；罗尧幸等［10］利用隶属函数法确定了‘无核翠宝’等7个鲜食葡萄品种的抗寒能力强弱；任静等［11］结合主成分分析法、聚类分析法以及相关性分析，评价了河西走廊‘贵人香’7个葡萄砧穗的抗寒性强弱；李桂荣等［12］利用灰色关联分析筛选出与葡萄抗寒性关联度最高的抗寒指标是丙二醛、SOD，其次是POD、可溶性糖含量；曹建东等［13］筛选出相对电导率、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖含量、可溶性蛋白质含量等指标作为评价葡萄抗寒性强弱的指标。通过嫁接获得的植株在抗逆性等品质方面会表现出类似砧木品种的优良特性，而目前对葡萄实生砧木抗寒性综合评判的研究少见报道。因此，本试验利用葡萄实生苗分生力强、生长发育快等特点，在课题组前期种质资源收集的基础上，选取14种不同葡萄砧木品种的种子为试材，设置4℃、0℃、−4℃和−10℃的梯度低温处理，观测其萌发和抗寒生理生化指标的动态变化，利用其变化来反映不同品种实生苗对低温胁迫的响应，得出不同品种葡萄砧木实生苗间的抗寒性差异，为葡萄育种提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验选取14个不同葡萄砧木品种为试验材料（表1），取自山西省农科院果树研究所国家果树种质太谷葡萄资源圃（37°20′37″N，112°29′33″E，海拔833 m±4 m），所选植株生长势强，采用单篱架式种植，株行距为1.5 m×2.5 m。

1.2 试验方法

2017年9月8日采收葡萄完熟浆果，取出种子洗净，沙藏后于次年3月28日挖出，用2 500 mg·L-1的GA3浸种24 h后将种子置于培养室进行催芽，各品种取籽500粒。露白后采用点播法播种，每日观察种子出芽及生根情况，待实生苗长出1～2片真叶时移栽至营养钵中继续培育。随机选择长势优良、健康无病害的14个葡萄砧木实生苗各30株，以25℃为对照，设置4℃、0℃、−4℃及−10℃的低温处理，升降温速率均为4℃·h-1，降温至目标温度后维持12 h，然后升温至25℃后再维持12 h后进行随机取样。各温度处理时均无光照，取样位置约为第3～5片叶。

1.3 指标测定

1.3.1 砧木种子萌芽情况及出苗率测定

催芽后每日观察记录种子的萌芽情况。播种后10 d计算出苗率，记录生根数并测定根长［18］。

1.3.2 实生苗抗寒生理指标的测定

葡萄叶片相对电导率的测定参照董万鹏等［19］的方法，叶绿素含量的测定采用乙醇比色法，可溶性糖含量的测定采用蒽酮法，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法，丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸法，游离脯氨酸含量的测定采用茚三酮比色法，POD活性的测定采用愈创木酚法，SOD活性测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法，CAT活性测定采用H2O2法［20］。

1.3 数据处理

灰度关联分析参照杨光华等［21］的方法，选取关联度较高（＞0.40）的抗寒指标，采用隶属度分析法结合分层聚类，依照隶属度均值将实生苗抗寒性分为三级［22］，平均值0.45～0.50为高抗寒品种，0.30～0.45为中抗寒品种，0.25～0.30为抗寒品种。

试验对3次生物学重复数据进行统计分析，利用Excel 2013软件和SPSS 21.0进行数据处理与统计分析，并用GraphPad Prism 7.0制图。

2 结果与分析

2.1 葡萄砧木种子的萌发和实生苗的培育

由图1可见，‘5BB’、‘140R’葡萄种子的萌发速度较快，分别在催芽后7 d和9 d观察到子叶的萌发，而大部分种子在催芽后9 d只长出1条主根、2～3条侧根，其中‘双优’的萌发速率最慢，催芽后9 d才观察到种子露白的情况。由表2可见，播种后10 d，‘绛县5号’成苗率最高，达到78.8%，其次为‘绛县4号’，可达63.3%，左优红的成活率最低，仅为19.4%。各品种实生苗的生根数与根长存在差异，其中‘绛县4号’、‘绛 县5号’、‘绛 县7号’的生根数均大于3.5，根长均长于2.5 cm，高于其他参试品种。

表1 供试葡萄砧木品种Table 1 The species of different grape rootstock varieties

图1 不同葡萄品种种子萌发动态Fig.1 Germination dynamics of different varieties grape seeds

2.2 低温对葡萄实生苗外观形态的影响

由图2可以看出，25℃时，实生苗茎叶和根系外观形态正常，在4℃和0℃胁迫下，部分葡萄品种叶片出现黄化现象；−4℃时，‘左优红’等部分品种茎叶开始出现萎蔫，呈灰褐色，根系有变黑现象出现；−10℃时，所有品种均出现茎叶失水变脆，根系变黑。

2.3 低温对葡萄实生苗抗寒生理生化指标的影响

由图3可见，随着温度降低，各葡萄叶片的相对电导率表现出逐渐升高的趋势，叶绿素含量则整体呈现下降的趋势。叶片可溶性糖含量表现出显著变化，随胁迫温度的降低，‘北醇’和‘绛县4号’的叶片可溶性糖含量呈现先下降后上升再下降的趋势，而其余品种基本呈现相反的趋势。‘双优’叶片的可溶性蛋白含量随着胁迫进行表现出上升的趋势，在−10℃时达到最高，其余品种则均表现先下降后上升再下降的趋势，与可溶性糖规律 一 致。‘绛 县 复 叶 葡 萄’、‘山 河1号’、‘绛 县7号’的叶片脯氨酸含量呈现先升后降的变化趋势。叶片的MDA含量在胁迫前期，即从25℃降至4℃时，基本表现为活性上升；在整个胁迫范围内，含量均为总体累积。25℃时各品种叶片CAT活性均呈现较高的活性，胁迫前期，活性均大幅度下降，在0℃时基本都达到最低值。不同品种POD活性呈不同的变化趋势，‘SO4’、‘双优’和‘山河4号’的POD活性先上升后下降，‘左优红’、‘5BB’、‘北醇’、‘绛县 复 叶 葡 萄’、‘140R’、‘绛 县4号’、‘绛县5号’、‘绛县7号’和‘绛县10号’则表现相反的趋势，两种变化差异显著，‘山河1号’叶片POD活性则随温度降低而不断上升且无显著差异。葡萄叶片的SOD活性基本在25℃时含量达到最高，在胁迫温度到达4℃时，含量均迅速下降，之后基本趋于稳定。

表2 不同葡萄实生苗成活率（平均值±标准误）Table 2 Survival rate of different grape seedling（Means±SE）

图2 低温处理对葡萄实生苗外观形态的影响Fig.2 Effect of low temperature treatment on the appearance of grape seedlings

2.4 葡萄实生苗抗寒性综合评价

由表2可以看出，根据灰色关联度结果，抗寒指标由高到低排序为：SOD活性＞可溶性糖＞叶绿素＞相对电导率＞可溶性蛋白＞脯氨酸＞丙二醛＞CAT活性＞POD活性。

对14个葡萄品种的抗寒平均隶属度排序进行聚类分析，结果如图4所示。由图4可以看出，14个葡萄品种可以分为3类，‘绛县4号’为高抗寒品种，‘5BB’、‘左优红’、‘绛县7号’、‘绛县5号’、‘山河4号’、‘北 醇’、‘山 河1号’、‘绛 县 复 叶 葡 萄’、‘140R’和‘双丰’为中抗寒品种，‘SO4’、‘双优’和‘绛县10号’为抗寒品种。

3 讨论

葡萄实生苗的生长过程中，光照、温度、水分和培育基质的特性等均是影响实生苗成活的关键因素［23］。本试验中葡萄实生苗成苗率参差不齐，经分析与移栽后缓苗不当和基质保水性差有关，使得移栽后造成一定数量的实生苗死亡。据此，葡萄实生苗栽培条件仍需进一步的研究和改进。

图3 低温处理对葡萄实生苗叶片抗寒生理指标的影响Fig.3 Effects of low temperature treatment on physiological indexes of cold resistance of grape seedling leaves

植物膜系统是植物受低温伤害的原发部位，相对电导率能较直观且准确地反映出植物细胞膜在低温下的受胁迫程度，电导率越大，细胞膜受害程度越深，抗寒性越弱，反之抗寒性越强［24，25］。本试验结果表明14种葡萄叶片相对电导率随温度的降低而呈现升高的趋势，可见低温胁迫使葡萄实生苗叶片生物膜透性增大并且膜受损程度加重。低温环境不仅会造成叶绿素和类胡萝卜素的含量比例失衡，还会导致与蛋白质结合的叶绿体色素含量发生变化，大部分植物在低温胁迫下叶绿素含量会降低［26］。本试验结果表明，随着温度降低，参试葡萄叶片叶绿素含量呈现下降的趋势，分析原因可能是低温使其代谢缓慢，合成叶绿素的原料不足，造成叶绿素含量减少，验证了上述说法。

在低温环境下，植物体内各种渗透调节物质大量积累，赋予植物多种渗透调节的能力，如可溶性糖、可溶性蛋白质、游离脯氨酸等均是重要的抗寒指标［27］。有研究表明［28］低温处理下可溶性糖、可溶性蛋白含量和脯氨酸等植物体代谢物质变化越大，植物组织抗寒性越强，变化越小抗寒性越弱。本试验中随着胁迫温度的降低，从整体上看，供试葡萄叶片的可溶性糖含量基本呈现先上升后下降再上升的趋势，最终含量相较初始值基本增加，表明植株通过积累可溶性糖含量来提高细胞的渗透势；可溶性蛋白与游离脯氨酸含量在0～4℃期间基本处于上升的趋势，有利于抗寒，但在5个温度间，脯氨酸含量变化趋势无明显规律，与赵国栋等［29］的研究结果一致。

丙二醛含量被作为衡量植物抗寒性的重要参数［29］。有研究表明低温处理后，植物体内MDA含量会增加。本试验中葡萄砧木MDA含量在低温处理下变化的趋势从整体上来看，胁迫后的MDA含量均高于低温胁迫初始时的含量，即随着胁迫的进行，MDA含量逐渐累积，而增加幅度不一，与高述民等［30］的研究一致。SOD、POD和CAT共同构成植物组织的活性氧清除系统，使活性氧处于动态平衡，进而保护膜结构免受低温的破坏［31，32］。本试验结果表明，参试葡萄的SOD活性与CAT活性的变化趋势从整体上看基本呈现一致的趋势，低温胁迫前期均呈现较高的活性，随着胁迫进行活性迅速下降，随着温度持续降低而逐渐保持稳定，呈现出一定的规律性，表明环境温度诱导了这两种酶活性的变化，使得细胞膜处于活性氧积累和清除的动态平衡中，从而保护细胞不受到伤害。而POD活性则表现不一样的变化情况，但均呈现一定的规律性且之间差异明显，这也一定程度上反映了葡萄植株中氧化反应的生理变化，抗氧化酶的变化说明植株对低温产生了一定的响应。

表3 不同品种葡萄生理生化指标与抗寒性的灰色关联度Table 3 Grey correlation degree between physiological and biochemical indexes and cold resistance of different grape varieties

钟海霞等［33］通过对7个葡萄砧木根系的抗寒性研究得出，‘5BB’根系的抗寒力强于‘SO4’。李鹏 程 等［16］的 研 究 评 价 了‘5BB’、‘山 河1号’及‘SO4’等8种引进葡萄砧木的抗寒性，得出‘5BB’、‘山河1号’的抗寒性均强于‘SO4’。本试验通过聚类分层分析将‘5BB’、‘山河1号’聚为中抗寒品种，‘SO4’为抗寒品种，与前人研究结果具有一致性。苏李维等［34］对‘双优’、‘左优红’等葡萄一年生枝条进行抗寒性评价得出，‘双优’枝条的抗寒性优于‘左优红’。而本试验通过聚类分层得出，‘左优红’为中抗寒品种，‘双优’为抗寒品种，与前人研究有差异，分析原因可能是选材差异。前人研究选择一年生成年枝条，而本试验选择砧木实生苗为试材，可能是所取材实生苗的木质部比一年生枝条抗寒力稍强，在可溶性糖、可溶性蛋白质和游离脯氨酸等含量稍有差异，造成所得结果不一致。由于植物是一个复杂的有机体，易受到逆境胁迫引起的植物生理指标变化，在具体评定葡萄抗寒性时，还需要结合田间观察等综合评价，以获得更为科学、精准的结果。

4 结论

本研究运用隶属函数法与聚类分析法对14个品种进行比对筛选，分别得出了高抗寒、中抗寒与抗寒品种，以此来作为综合评价的最终结果。最终综合葡萄种子萌发情况、实生苗成活率和抗寒性等指标，筛选出‘绛县4号’为葡萄实生耐寒砧木品种。这一结果为加速葡萄抗寒性研究提供了科学依据。关于葡萄砧木品种抗寒的分子生物学机理有待继续研究，今后将继续探究其分子机制。